Во время хранения в семенах происходят и накапливаются повреждения хромосом. Доказательства этого положения в основном получены в результате трех типов наблюдений: 1) исследование частоты хромосомных аномалий, особенно в первых митозах, протекающих в клетках корешков прорастающих семян Ai1; 2) исследование частоты недоразвития пыльцы у растений Ai: 3) исследование фенотипических мутаций у растений Аг и Аз. Несколько важных серий работ было проведено в 1933 г. Навашин, работавший с семенами Crepis tectorum, и Пето т исследовавший семена кукурузы, независимо друг от друга впервые обнаружили в корнях растений, развившихся и» старых семян, высокую частоту видимых хромосомных аберраций. В это же время Картледж и Блэксли показали, что у старых семян Datura мутации, приводящие к недоразвитию пыльцы,, встречаются чаще. В дальнейших работах этой группы было установлено, что старение семян также вызывало высокую частоту фенотипических мутаций. Работы Навашина и Герасимовой на другом виде Crepis подтвердили результаты более-ранней работы, касавшейся увеличения числа хромосомных аберраций, которые можно было обнаружить в молодых корнях путем цитологических наблюдений. В дальнейшем многие исследователи сообщали о повышении с возрастом семян частоты хромосомных аберраций лука; лука-батуна; гороха; твердой и мягкой пшеницы; ячменя; ржи и гороха; салата и кукурузы. В большинстве ранних работ наблюдается стремление связать-видимые повреждения хромосом или симптомы их повреждений с возрастом. Но постепенно становится очевидным, что хронологический возраст семени является не единственным фактором, способствующим появлению хромосомных аберраций. Доказательство важного значения таких факторов, как температура и влажность во время хранения, были получены не только в результате цитологических исследований на Crepis, но и при изучении недоразвития пыльцы у Datura, проведенном Картледжем, Бартон и Блэксли. Последние пришли к выводу, что «в общем частота мутаций возрастала по мере повышения температуры, влажности семян и продолжительности экспозиции».
О важном значении температуры свидетельствуют также многочисленные исследования, показавшие, что тепловая обработка вызывает разрыв хромосом. Однако не всегда принималось во внимание, что тепловой обработкой можно считать воздействие любой температурой выше абсолютного нуля. Пето сообщает, что при экспозиции семян ячменя в течение 25 мин при 95° С или в течение 30 дней при 40° С и высокой влажности наблюдалось появление хромосомных аномалий. В ряде работ Навашина и Шкварникова на пшенице и Crepis было показано, что воздействие на свежие семена температурой 50—60° С в течение 20 дней оказало на появление хромосомных аберраций такое же влияние, как старение при комнатной температуре в течение 6—7 лет.. Сообщалось также, что повышение относительной влажности воздуха, в свою очередь, увеличивало частоту хромосомных аберраций, особенно при высоких температурах. В противоположность этому Смит указывал, что экспозиция семян зерновых культур в течение 5—15 дней при 50— 70° С или в течение 45—80 мин при 80° С практически почти не влияла на частоту хромосомных аберраций. Но за исключением работы Смита, все другие данные подтверждают точку зрения, согласно которой повреждение хромосом в семенах во время хранения может быть ускорено в результате комбинированного действия температуры, влажности семян и времени. В обычных условиях хранения в дополнение к температуре и влажности кислород также может способствовать повреждениям ядер. Однако первые данные о роли этого фактора вызывали некоторые сомнения. Шкварников сообщал, что хранение «свежих семян в течение 20 дней в атмосфере чистого углекислого газа, азота или кислорода увеличивало частоту мутаций, кроме того, он указывал, что к аналогичному результату приводило повышение или понижение содержания кислорода в воздухе. Позднее Мутшен-Дамен, Мутшен и Эренберг изучали влияние давления кислорода в 30—60 атм в течение 3—28 дней на семена конских бобов. Высокая частота разрывов вызывалась, как было доказано, именно влиянием кислорода, поскольку использование в аналогичных условиях азота практически никакого воздействия не оказывало. Джексон сообщал, что разрыв хромосом в семенах лука усиливается при хранении в среде с повышенной концентрацией кислорода. Приведенный краткий обзор показывает, что возникновение повреждений хромосом в процессе старения семян зависит, вероятно, от интеграции с течением времени воздействий температуры, влажности и кислорода. Эти три фактора в основном контролируют период жизнеспособности семян, поэтому возможно, что существует какая-то связь между накоплением повреждений хромосом и потерей жизнеспособности.
В настоящее время можно точно определить характер снижения жизнеспособности семян, это дает возможность подойти к исследованию зависимости между утратой жизнеспособности и накоплением повреждений хромосом с качественно новых позиций. В исследованиях, проведенных на горохе, бобах и ячмене, для обеспечения разных скоростей снижения жизнеспособности семена экспонировали при различных комбинациях температуры и влажности и через определенные промежутки времени определяли потерю жизнеспособности и накопление повреждений хромосом. Цитологические исследования проводились на первых делениях меристематических клеток кончиков корешков, образовавшихся у выживших семян, заложенных на проращивание. В предварительных опытах были изучены различные аномалии, встречающиеся во всех фазах митоза, и было установлено, что больше всего разрывов можно обнаружить в анафазе. Поэтому в каждом варианте просматривали 300 клеток находящихся в анафазе; те из них, в которых были видны мосты или фрагменты, относили к аберрантным и выражали в процентах от всех просмотренных клеток. Результаты опытов с конскими бобами представлены на рисунке 37, где показаны также кривые выживаемости для соответствующих вариантов. С первого взгляда видно, что с увеличением экспозиции повреждения хромосом усиливаются и. что если примененное воздействие приводит к быстрой потере жизнеспособности, то оно ведет и к быстрому накоплению аберраций. На рисунке 38 полученные данные нанесены на график иным способом, и из него становится ясно, что для всех вариантов опытов, кроме одного, каждому из выживших семян соответствует одна и та же средняя частота появления аберрантных клеток. Таким образом, независимо от того, какова •скорость снижения жизнеспособности и какой фактор окружающей среды его главным образом вызывает, доля аберрантных клеток у выживших экземпляров является функцией относительной жизнеспособности. Очень сходные результаты были получены для семян гороха и ячменя. Как обсуждается подробнее в других статьях, асимптотическую природу этих кривых можно объяснить тем, что семя, содержащее повреждения хромосом в количествах, превышающих критическое, становится нежизнеспособным и автоматически исключается из образца,.предназначенного для цитологического исследования. Исключение из этого правила составил у всех трех видов самый неблагоприятный вариант хранения, при котором средний период жизнеспособности составлял меньше недели. В этом случае каждому значению относительной жизнеспособности у выживших семян соответствовала меньшая частота аберрантных клеток, чем во всех других вариантах. Это свидетельствует о том, что в самых неблагоприятных условиях экспозиции может действовать какой-то дополнительный отрицательный фактор, который не находит отражения в разрывах хромосом. По-видимому, аналогичное явление наблюдал Харрисон в опытах с семенами салата. По его данным, 2—5-дневное выдерживание семян с влажностью 10% при температуре. 40° С приводило к снижению их всхожести в пределах от 65 до 6%. В этих образцах накапливалось значительно меньше анафазных аберраций, чем в семенах с такой же всхожестью, но терявших жизнеспособность медленно. Отсюда следует, что, хотя между снижением жизнеспособности и накопленнием хромосомных повреждений существует превосходная корреляция, эта взаимосвязь может нарушиться в очень неблагоприятных, условиях хранения, когда снижение жизнеспособности может оказаться сильнее, чем следовало ожидать при том количестве повреждений хромосом, которое наблюдалось после определенного периода времени. Результаты опытов, в которых скорость снижения жизнеспособности увеличивали путем повышения парциального давления кислорода, также свидетельствуют о наличии тесной корреляции между потерей жизнеспособности и частотой появления аберрантных клеток у выживших зародышей, если другие условия хранения неэкстремальны. Данные, характеризующие жизнеспособность семян и средний процент аберрантных клеток у выжившей популяции после хранения в течение 35 дней при умеренных условиях или после трехдневного хранения при очень неблагоприятных условиях. Можно видеть, что в обоих случаях повышение концентрации кислорода с 0 до 21% увеличивало скорость снижения жизнеспособности и одновременно повышало частоту появления аберрантных клеток. При более благоприятных условиях хранения цифры, характеризующие зависимость между всхожестью и частотой аберрантных клеток, очень сходны с цифрами, полученными ранее, при большинстве условий хранения. Однако, как было установлено предварительно, при очень неблагоприятных условиях хранения семена обычно погибают раньше, чем накопится определенное число разрывов хромосом. Эти результаты, в свою очередь, подчеркивают, что почти при всех условиях хранения существует весьма тесная связь между повреждением хромосом и снижением жизнеспособности независимо от того, какие факторы окружающей среды ее вызывают. Результаты некоторых работ Харрисона и Мак-Лиша по хранению семян салата в атмосфере различных газов свидетельствуют о том, что кривая, иллюстрирующая зависимость между жизнеспособностью и частотой аномальных анафаз, по существу сходна с кривой, описанной для семян гороха, бобов и ячменя. Однако максимальная частота аберраций здесь гораздо выше: при снижении жизнеспособности семян салата до 50% доля аномальных анафаз в корешках составляла почти 90%. Харрисон и Мак-Лиш исследовали также семена лука и обнаружили низкую частоту разрывов хромосом на всех уровнях всхожести, из чего они заключили, что «снижение всхожести не обязательно сопровождается повышением частоты аномальных клеток». Однако в этом опыте график был построен только по трем точкам, и наивысшая всхожесть семян была всего лишь 76%; при этой и более низкой всхожести частота аномальных анафаз составляла от 10 до 15%. Хотя эти частоты невысоки по сравнению с наблюдаемыми у салата, они близки к значениям для гороха и бобов и превышают полученные для ячменя. Поэтому, учитывая все вышесказанное-и отсутствие данных о частоте аберраций при высокой всхожести, можно сомневаться в правильности вывода об отсутствии корреляции между жизнеспособностью и частотой аберрантных клеток у лука. Об этом свидетельствуют также опыты Николса и Сакса, в которых было показано, что с удлинением периода хранения частота появления аберрантных клеток у лука увеличивается. Для подтверждения выводов, полученных на основании цитологических исследований семян гороха, бобов и ячменя, была изучена зависимость между снижением жизнеспособности, вызванным различными комбинациями температуры и влажности семян, и индукцией мутаций во время хранения. При этом применялись два метода. Первый был основан на предположении, что многие рецессивные мутации могут оказаться летальными и проявляться только в гаплоидном состоянии, соответственно была исследована абортивность пыльцы у растений Аь Второй метод основывался на возможности самоопыления растений At и исследовании потомства да присутствие рецессивных хлорофильных мутантов в поколении Аг. Для снижения жизнеспособности примерно до 50% были использованы различные комбинации трех факторов, применявшиеся в других опытах, и выжившие в этих условиях семена сравнивали с контрольными, которые хранились в- хороших условиях и сохранили первоначальную высокую жизнеспособность. На «сновании гипотезы о том, что генетические повреждения являются функцией снижения жизнеспособности, можно было ожидать, что эти варианты дадут одно и то же число мутантов. Фактически исследования были поставлены недостаточно широко, чтобы обеспечить необходимую точность испытаний, но во всяком случае можно сказать, что результаты, не противоречат этой гипотезе. На основании этих результатов можно предположить, что в большинстве условий хранения относительная жизнеспособность служит хорошим показателем наличия в выживших семенах разрыва хромосом и генной мутации независимо от того, как быстро снижается жизнеспособность и какой из факторов окружающей среды оказывает во время хранения наиболее отрицательное воздействие. В этих опытах изучали мутации относительно небольшого числа генов: только тех, которые влияли на недоразвитие пыльцы, и немногих из генов, определяющих недостаточность хлорофилла. Они, несомненно, составляют очень небольшую долю общего комплекса генов. Однако при хранении семян в условиях, приводящих к потере 50% жизнеспособности, частота мутаций генов, влияющих на образование хлорофилла, повысилась с крайне низкого уровня до 1—3%. Поэтому, вероятно, можно допустить, что общее число всех типов генных мутаций, индуцированных в популяции выживших семян, должно очень сильно повыситься. Хотя приведенные выше данные свидетельствуют о том, что генные мутации возникают в таких условиях хранения, которые приводят к снижению жизнеспособности примерно на 50%, имеется несколько прямых доказательств возникновения наследуемых мутаций при хранении семян в условиях, вызывающих только слабое снижение жизнеспособности. Калдекотт показал, что в семенах ячменя частота хлорофильных мутаций, вызванных рентгеновским облучением в анаэробных условиях, прямо пропорциональна частоте хромосомных аберраций. Таким образом, при отсутствии доказательств противного мы можем принять, что относительная жизнеспособность является хорошим показателем наследуемых генетических мутаций, возникших в выжившей популяции. Эти результаты представляют практическую ценность для лиц, имеющих отношение к хранению семян генетических линий и к проектированию систем хранения семян, речь о которых шла в главе 2. Кроме того, умышленное создание плохих условий хранения можно использовать в качестве простого метода индукции мутаций в селекционной работе. Помимо работ, где использовали нормальные условия хранения, описанные до сих пор, были проведены опыты, в которых исследовали также корреляцию между жизнеспособностью и частотой хромосомных повреждений, вызываемых искусственными средствами. Так, имеется много данных, часть которых будет рассмотрена ниже, свидетельствующих о том, что ионизирующее излучение усиливает повреждение хромосом и в то же время снижает жизнеспособность. Особенно интересно отметить, что, по данным К. Сакса и X. Сакса, нормальное старение и рентгеновское облучение синергически влияют на возникновение хромосомных аберраций. Пример другого типа проводят Додсон и Ю, которые в течение 3 или 4 ч воздействовали на семена сорго, пшеницы и овса центробежной силой. По их данным, в диапазоне 5000—25000 g наблюдается отрицательная линейная зависимость между центробежной силой и жизнеспособностью, хотя раньше эти же авторы показали, что появление хромосомных аберраций у ячменя пропорционально используемой центробежной силе и времени воздействия.
Ненаследуемые морфологические аномалии
Кроме растений с рецессивными мутациями, которые проявляются не раньше чем в поколении Аг, из старых семян очень часто образуются явно ненормальные растения в поколении Аь В опытах с семенами гороха и бобов было показано, что любые условия хранения, приводящие к значительному снижению жизнеспособности, способствуют появлению аномальных растений в Аь Частота их появления, по-видимому, не связана с относительной жизнеспособностью, но у гороха они составляли 5% по сравнению с 0 в контроле; у конских бобов — соответственно 10 и 2%. В большинстве случаев на аномальных растениях завязывались жизнеспособные семена, но ни в одном случае не было отмечено наследования аномалий, и соответственно причина их появления неизвестна. Наиболее вероятно, что они обусловлены какими-либо цитоплаз-матическими или физиологическими изменениями, а не хромосомными. Мы не будем детально останавливаться на морфологических аномалиях, появляющихся в Ai, но вкратце укажем, что к ним относятся листья ненормальной формы, пятна, свидетельствующие о недостатке хлорофилла, ненормальное ветвление. Картледж, Бартон и Блэксли обнаружили сходные аномалии у растений, развившихся из старых семян Datura. Своеобразная морфологическая аномалия — прищипнутые кончики корней — часто наблюдается у проростков, развившихся из старых семян хлопчатника. Харрисон сообщал о появлении в Ai салата карликовых и хлоротичных растений. Доля каждой аномалии варьировала в зависимости от условий хранения, и генетический статус их неизвестен.
Накопление мутагенов
Ингибиторы роста с мутагенными свойствами представляют собой особую категорию. Перед исследователями, изучавшими хромосомные аберрации и генетические мутации, сопутствующие снижению жизнеспособности, вставал вопрос, каковы же причины этих повреждений. Вероятно, мы не ошибемся, если скажем, что большинство исследователей считает, что повреждение хромосом происходит в результате накопления в семени аутомутагенных веществ.Данные, накопившиеся в дальнейшем, послужили материалом для обширной сводки, которую составили д'Амато и Хофман — Остенхоф. Они пришли к заключению, что «наиболее вероятными причинами утраты способности к прорастанию являются или летальные изменения хромосом, вызываемые аутомутагенными веществами, которые накапливаются в процессе старения семян, или более общее отравление зародыша, обусловленное накоплением аутотоксичных соединений». Джеймс полагал, что такими токсичными мутагенными веществами могут быть конечные продукты дыхания. В тех случаях, когда мутагены могут быть обнаружены, обычно трудно определить, являются они продуктами метаболизма самого семени или связанной с ними микрофлоры; исключение составляет старение семян в условиях, исключающих активность микрофлоры. В этой связи следует указать, что, как известно, некоторые продукты жизнедеятельности микрофлоры, присутствующей на семенах в период хранения, обладают мутагенными свойствами. Так, установлено, что афлатоксин вызывает в семенах Vicia faba разрывы хромосом. Поэтому в настоящее время мутагенные теории трудно разделить на внутренние и внешние. Однако большинство сторонников этой гипотезы считает, что мутагены образуются в самих семенах. Внимание исследований в данной области сосредоточено в основном на выделении и испытании мутагенных веществ. Однако многие доказательства, приведенные в основном обзоре по этому вопросу, не выдерживают критики. В некоторых случаях не испытывали контрольные экстракты из свежих семян, в то время как есть данные о наличии в них мутагенной активности; часто экстракты испытывали только на других видах, или при испытании на том же самом виде они не обладали мутагенной активностью; в ряде случае» экстракты были токсичны и обладали антимитотическими, но не мутагенными свойствами. Тем не менее, если откинуть все сомнительные факты, остается некоторое число убедительных доказательств, которые приводят ЗКиске, Хитье, Изар и Муна, обнаружившие, что масло, отжатое из старых семян табака, оказывало на тот же вид мутагенное действие, тогда как экстракты из молодых: семян такой активностью не обладали. Недавно Джексон сообщил об опыте, в котором свежие семена лука обрабатывали вытяжками из старых или свежих семян. Вытяжки из старых семян вызывали разрыв хромосом. В опыте отсутствовал статистический контроль, поэтому эти результаты следует расценивать как предварительные. В недавних опытах с семенами гороха, бобов и ячменя не было обнаружено никакой мутагенной активности. Исследовали водный,.этанольный и эфирный экстракты, а также вытяжки, приготовленные по методу Джексона. Хотя водные экстракты и обладали способностью ингибировать рост, никаких различий между экстрактами из свежих семян и из семян, потерявших 50% жизнеспособности в результате двух вариантов искусственного старения, обнаружено не было. В опытах с взаимной пересадкой молодых и старых зародышей и эндоспермов Triticum durum, которые провел Флорис, были получены следующие результаты: при пересадке молодого зародыша на молодой эндосперм всхожесть составила 94%; молодого зародыша на старый эндосперм — 76%; старого зародыша на молодой эндосперм—13%; старого зародыша на старый эндосперм—18%. Различия между двумя последними цифрами недостоверны, но между двумя первыми разница вполне достоверна и показывает, что ингибиторы, накапливающиеся в эндосперме, могут подавлять прорастание. В ходе дальнейших исследований было показано, что эндосперм семян, хранившихся до четырех лет в лаборатории, не оказывал существенного влияния на прорастание пересаженных на них : молодых зародышей, хотя некоторое подавление роста проростков наблюдалось. Жизнеспособность четырехлетних зародышей составляла 31%. Однако пятилетние эндоспермы с примерно такой же жизнеспособностью подавляли прорастание молодых зародышей, с которыми были соединены, снижая прорастание с 90% для молодых гомотрансплантатов до 53% У гетеротрансплантатов — старых зародышей, пересаженных на молодые эндоспермы. Поэтому данные опыты показывают, что ингибиторы прорастания, образующиеся в эндосперме, могут значительно подавлять прорастание в условиях, вызывающих существенное снижение жизнеспособности. Проведя сходные опыты с пересадкой, Кореи и Аванци пришли к выводу, что вызванное старением повреждение хромосом у зародыша не является результатом старения эндосперма, хотя он и может обусловливать незначительный уровень хромосомных повреждении. В этом контексте интересно отметить, что мутагенный эффект эндосперма, облученного рентгеновскими лучами, передается гораздо сильнее, что еще раз подчеркивает упоминавшуюся :выше разницу между воздействием облучения и явлением естественного старения.
Повреждение цитоплазматических органелл
Хотя уже давно известно, что снижение жизнеспособности связано с накоплением ядерных повреждений, данные о повреждении цитоплазматических органелл еще только начали появляться. Это объясняется тем фактом, что получение прямых доказательств повреждения внеядерных органелл стало возможным лишь после того, как биологи начали использовать в своих исследованиях электронный микроскоп. Абу-Шакра и Чинг исследовали активность митохондрий в двух образцах семян сои ; возраст одного из них составлял несколько месяцев, а другого — три года. Оба хранились в сухих условиях при комнатной температуре. Хотя семена во втором образце были гораздо старше, чем в первом, всхожесть и тех, и других превышала 80%. Однако скорость роста проростков, образовавшихся из более старых семян, была значительно ниже. Опыт проводили на митохондриях, выделенных из осей проростков через четыре дня после того, как семена были заложены на проращивание. Хотя скорость поглощения кислорода в обоих вариантах была примерно одинакова, митохондрии из свежих семян этерифи-цировали в два с лишним раза больше неорганического фосфата, чем митохондрии из старых семян; отношение Р/О составляло соот-ветственно 3,0 и 1,4. Это свидетельствует о том, что в митохондриях из старых семян, нарушено сопряжение. Электронные микрофотографии показали, что митохондриальная фракция, выделенная из молодых семян, содержит интактные и вздутые митохондрии, а также пластиды и пузырьки. Аналогичная фракция из старых семян содержала митохондрии с расширенными или вздутыми кристами и коагулированным матриксом, у некоторых из них отсутствовала интактная наружная мембрана. Абу-Шакра и Чинг полагали, что эти морфологические особенности могут и не быть причиной отсутствия эффективности, так как такие же признаки были обнаружены у функционирующих митохондрий, выделенных из Другого растительного материала. Тем не менее уплотнение матрикса является отличительной чертой митохондрий из старых семян. Эти авторы сообщали также, что число митохондрий на проросток в старой ткани было, по-видимому, ниже, чем в новой. Однако без дополнительных исследований трудно установить, являются эти количественные различия функцией возраста семян или скорости роста проростка. Для более достоверного распознавания возможных морфологических различий Абу-Шакра и Чинг предложили проводить исследования in situ. Бержак и Вилье использовали этот метод при изучении семян кукурузы. В серии опытов они изучали также изменения, происходящие во всех других различимых клеточных органеллах. В ходе этих исследований сравнивали семена кукурузы, не подвергавшиеся старению, и семена с влажностью 14%, экспонировавшиеся до 34 дней при 40° С. В этих условиях средний период жизнеспособности составлял около 18 дней, а к 30-му дню она полностью утрачивалась. Изучение давленых препаратов корешков подтвердило, что накопление хромосомных аберраций до некоторой степени напоминало процесс, уже описанный для гороха, бобов и ячменя. Кроме того, кривая, отражающая зависимость между процентом жизнеспособности и процентом аберрантных клеток в выживших семенах, относилась по существу к тому же типу, что и кривая, которую приводят Абдалла и Роберте. У кукурузы относительное число аберрантных конфигураций в анафезе возрастало, асимптотически приближаясь к 9%. Наблюдения за ядром проводились под световым микроскопом, изучение же цитоплазматических органелл было проведено Бержак при помощи электронного микроскопа. Семена, используемые для этих наблюдений, замачивали в воде при 25° С на 12, 24 и 48 ч. Хотя некоторые наблюдения проводились на цельных кончиках корней, детальные исследования были ограничены корневым чехликом, поскольку это давало возможность изучить два различных процесса старения. Первый процесс представляет собой организованное старение клеток корневого чехлика по мере их удаления от калиптрогена. Он происходит во время роста корня и необходим для эффективного функционирования корневого чехлика, которое, как показали наблюдения Бержак, характеризуется повышенной секреторной активностью диктиосом и выделением лизосомных ферментов. Предполагается, что этот тип старения запрограммирован генетически. Но в настоящей книге мы в основном уделяем внимание второму процессу старения, который можно наблюдать в клетках корневого чехлика, т. е. незапрограммированным изменениям, происходящим в хранящихся семенах. При изучении ультраструктуры корневых чехликов семян, которые старели в течение 18—20 дней, были обнаружены разнообразные дегенеративные изменения. По интенсивности происходящих в семенах изменений зародыши были разделены на типы 1, 2 и 3 в порядке усиления серьезности повреждения. Старение коснулось всех органелл, но у зародышей типа 1 повреждения были в значительной мере обратимы: аномалии, появившиеся после набухания семян в течение 12 ч, через 24 или 48 ч нередко исчезали, по-видимому, в результате действия репарационных механизмов. Но у зародышей типов 2 и 3 повреждения в большинстве случаев оказывались необратимыми. Зародыши типа 3 и, вероятно, типа 2 почти несомненно нежизнеспособны. В контроле наблюдались типичные особенности ультраструктуры клеток корневого чехлика. С увеличением возраста семян усиливается тенденция к разделению ядра на лопасти. В то же время хроматин становится более восприимчивым к окрашиванию перманганатом калия. Среди органелл одними из первых претерпевают изменения пластиды, что выражается в деформации внутренней и наружной мембран, сопровождающейся вздутием органелл и уменьшением плотности матрикса. Дегенерация диктиосом начинается с разъединения цистерн, за которым следует их исчезновение. Происходит деформация контуров эндоплазматической сети, первые признаки которой появляются прежде всего в клетках чех-лика и выражаются в увеличении диаметра просветов цистерн; по мере дальнейшего старения контуры ЭС становятся длиннее и тоньше, часто наблюдается значительная гипертрофия; в конце концов у зародышей типа 3 сохраняются только короткие раздутые контуры. В нестаром материале образование полисом становится заметным через 12 ч после начала набухания, но у зародышей старых семян рибосомы на этой стадии набухания по-прежнему в значительной степени разъединены. Считают, что это изменение является скорее результатом замедления метаболизма, чем разрушения иРНК. У зародышей типа 3 на любой стадии видны только моносомы. Как и пластиды, митохондрии относятся к органеллам, которые первыми претерпевают изменения, связанные с возрастом. Их форма становится неправильной, и кроме того, бывает ясно заметна дезорганизация внутренней мембраны, особенно в зоне зрелых клеток; нередко в них возникает своеобразное внутреннее пространство, ограниченное мембраной. У зародышей типа 3 наблюдаются признаки экстремальной дегенерации: митохондрии отличаются слабо выраженной внутренней структурой, и наблюдающаяся на ранних стадиях деформация мембран, по-видимому, исчезает, поскольку органеллы набухают, вероятно, вследствие потери контроля за переносом электронов и одновременного уменьшения плотности матрикса. На промежуточных стадиях старения наблюдается преждевременное развитие лизосом, так что в зонах деления и дифференциации клеток обнаруживаются лизосомы второй фазы. В лизосомных вакуолях часто встречаются остатки митохондрий и пластид. У зародышей типа 3 лизосомы набухают и ограничивающие их мембраны часто кажутся дефектными; при удлинении периода набухания начинается общий распад органелл, и интактных лизосом видно мало. Их исчезновение подтверждается тем фактом, что на этой стадии в протоплазме распространяется кислая фосфатаза. Возможно, что практически все описанные дегенеративные изменения ультраструктуры являются результатом общего повреждения липопротеиновых клеточных мембран. Если ухудшение последних не зашло очень далеко, по-видимому, возможно частичное их восстановление. В противном случае дезорганизация клетки становится необратимой. Это предположение основано на некоторых данных, показывающих, что ЭС до некоторой степени может быть связана с газообменом, поскольку было установлено, что пролиферация ЭС наблюдается в растительных клетках при низких давлениях кислорода и у штаммов дрожжей, лишенных митохондрий. Если повреждение митохондрий является первым звеном в процессе ухудшения семян, можно ожидать, что по мере снижения жизнеспособности будет наблюдаться некоторое ослабление интенсивности дыхания семян, заложенных на проращивание. Тронберри и Смит сообщали о таком снижении у семян кукурузы, но корреляция с потерей жизнеспособности была в этом случае далеко не безупречной. Однако можно согласиться, что если вышеупомянутые компенсирующие механизмы действительно существуют, то, используя простые методы измерения дыхания, можно просто не зафиксировать снижения интенсивности митохондриального дыхания. Но если они отсутствуют, то экспериментально обнаруженные небольшие различия в потреблении кислорода между старыми и новыми семенами ячменя и пшеницы явно противоречат высказанному Бержак предположению о том, что повреждение митохондрий может быть главным фактором, предотвращающим прорастание старых семян. Нарушением целостности мембран по мере старения, видимо, можно объяснить тот факт, что из старых семян в среду, на которой проводится проращивание, выделяется больше метаболитов, чем из свежих. Это явление известно уже в течение некоторого времени, но одно из самых обширных исследований по этому вопросу принадлежит Чингу и Скулкрафту, которые сравнивали семена райграса и красного клевера, хранившиеся в различных условиях в течение десяти лет. Они показали, что существует некоторая корреляция, хотя и не безупречная, между снижением жизнеспособности, электропроводностью экстрактов из семян красного клевера и концентрацией в них Сахаров и аминокислот. Но у райграса корреляция с электропроводностью или концентрацией Сахаров была выражена очень слабо, а с концентрацией аминокислот несколько лучше. В главе 7 указано, что Такаянаги и Мураками разработали простые методы определения жизнеспособности на основе концентрации Сахаров в экстрактах из семян. Однако Абдул-Баки и Андерсон подвергли сомнению обоснованность такого метода испытаний по крайней мере для ячменя, обнаружив, что в быстро стареющих семенах эта корреляция нарушалась. Кроме того, несомненный интерес для настоящей дискуссии представляет их предположение о том, что концентрация глюкозы в экстракте скорее связана с концентрацией этого вещества в семени и поэтому может и не являться показателем целостности мембраны. Бержак и Вилье использовали метод радиоавтографии для изучения характера включения 3Н-тимидина во время четырехчасовой инкубации в конце 48-часового периода набухания. Эти опыты показали, что включение ограничивалось ядрами меристематической зоны чехлика, что указывает на репликацию в них ДНК. Доля меченых ядер составила 6% на чехлик. Но в зародышах семян, подвергавшихся искусственному старению в течение 10—14 дней, доля меченых ядер возрастала примерно до 8,5%. Это увеличение было обусловлено по крайней мере частично включением метки в клетках зон, которые в нормальном состоянии не являются меристематическими. При удлинении периода искусственного старения до 18—20 дней доля клеток чехлика с мечеными ядрами составляла менее 1%. В этих случаях включение носило случайный характер и редко происходило в зоне инициальных клеток или в зоне деления. Бержак и Вилье предложили два объяснения этого положения. Во-первых, это может означать, что мери-стематические клетки более чувствительны к повреждениям, происходящим в процессе старения, и замещаются клетками, обычно находящимися в покое и, как можно предполагать, менее подверженными повреждениям. По-видимому, это явление аналогично положению, когда клетки покоящегося центра меристемы корня начинают делиться после облучения рентгеновскими лучами и замещают поврежденные клетки меристемы. Во-вторых, это может свидетельствовать о повреждении репрессорных механизмов, ингибирующих репликацию ДНК в немеристематических клетках. Из приведенной дискуссии видно, что в настоящее время имеется много данных, которые показывают, что потере жизнеспособности семени предшествует возрастание повреждении практически всех клеточных органелл как в ядре, так и в цитоплазме. При повреждении ядер, за исключением крайне неблагоприятных условий хранения, наблюдается хорошая корреляция между степенью повреждений и потерей жизнеспособности независимо от того, как быстро снижалась жизнеспособность или какие факторы окружающей среды ее в основном вызывали. Эти обобщения справедливы для всех детально изученных видов. Теперь необходимо распространить эти исследования на другие виды и выяснить, какие изменения цитоплазматических органелл происходят при старении семян с различной скоростью и в разных условиях. Подобные работы помогут установить, какие изменения имеют наиболее важное значение. Андерсон, Бекер и Уортингтон опубликовали короткую статью, посвященную изменениям ультраструктуры в осях зародышей пшеницы в процессе хранения. Они сравнивали семена пшеницы, зараженные присущей им микрофлорой и хранившиеся 26 недель при 25°С и относительной влажности 75%, с контрольными семенами, хранившимися при —20°С. Были отмечены различные аномалии, в том числе изменения, которые интерпретировались как слипание липидных телец, отделение плазмалеммы от клеточных стенок и разрыв плазмалеммы. Они предполагали, что эти изменения явились результатом деятельности грибов, но, поскольку ее наличие и отсутствие нельзя отделить от влияния условий хранения, принять с уверенностью их интерпретацию пока невозможно, так как эти изменения могли быть результатом более прямого влияния условий хранения на клеточные органеллы. В дальнейшей работе необходимо разграничить непосредственное воздействие окружающей среды и возможное косвенное влияние микрофлоры на повреждение клеточных органелл. Хотя настоящий обзор посвящен главным образом нормальным семенам, жизнеспособность которых была повышена путем снижения их влажности, необходимо упомянуть, что у семян с довольно высокой оптимальной влажностью с потерей жизнеспособности могут быть связаны совершенно иные цитологические факторы. Например, Генкель и Ши-Хсу связывали снижение жизнеспособности семян кофейного дерева с распадом плазмодесм.
Теории жизнеспособности
Кроме сведений о генетических и цитологических изменениях, происходящих в семенах во время хранения, имеется много данных о разнообразных метаболических различиях между молодыми и старыми семенами. Мы не стремимся дать их полный перечень. Следует отметить, что в большинстве случаев не было обнаружено тесной корреляции между различиями, связанными с возрастом, и снижением жизнеспособности. В настоящей главе речь будет идти лишь о тех изменениях, которые используются в некоторых теориях, предложенных для объяснения потери жизнеспособности. Более подробные сведения по этому вопросу можно найти в других обзорах. Мы до сих" пор не знаем, почему семена теряют жизнеспособность, но недостатка в теориях по этому вопросу не ощущаем. Я попытался классифицировать важнейшие из них на рисунке 53, из которого видно, что теории жизнеспособности удобно разделить на две группы. Авторы теорий первой группы предполагают, что гибель семян происходит в результате воздействия внешних факторов; авторы теорий второй группы считают, что гибель наступает в результате процессов, происходящих в самих семенах. Оба типа могут до некоторой степени перекрывать друг друга. Так, согласно теории, нашедшей довольно широкую поддержку, потеря жизнеспособности является результатом повреждения ядер, но последнее может происходить вследствие как внутренних, так и внешних событий.
Ионизирующее излучение
Неоднократно высказывалось предположение, что в обычных условиях хранения снижение жизнеспособности может быть вызвано вредоносным действием фоновой ионизирующей радиации. Эта мысль основана на общеизвестном факте, что применение повышенных доз радиации может ускорить потерю жизнеспособности семян и старение других организмов. Кроме того, ионизирующая радиация вызывает появление мутаций и хромосомных аномалий, которые, как мы видели, тесно связаны со снижением жизнеспособности семян. Тем не менее существуют по крайней мере три веских аргумента в пользу того, что фоновая радиация не может играть важную роль при нормальных условиях хранения. Во-первых, имеется много данных, что в смысле снижения жизнеспособности и ослабления роста проростков или индукции рецессивных мутантных фенотипов ионизирующее излучение сильнее повреждает диплоидные виды, чем полиплоидные, в то время как Смит указывал, что в немногих исследованиях, посвященных долговечности полиплоидных и диплоидных семян, нет никаких указаний на благотворное влияние полиплоидии. Отсюда следует, что при нормальных условиях снижение жизнеспособности обусловлено не радиацией. Во-вторых, было показано, что вредное Действие рентгеновских лучей на семена ячменя, определяемое по характеру развития проростков или по появлению хромосомных аберраций, усиливается при понижении влажности семян, в то время как установлено, что в обычных условиях хранения ядерные повреждения и потеря жизнеспособности при уменьшении влажности семян ослабевают. В-третьих, экстраполяция экспериментальных кривых доза — реакция от ионизирующей радиации к фоновому уровню показывает, что последний не мог быть причиной снижения жизнеспособности, наблюдающегося при многих обстоятельствах. Эти аргументы свидетельствуют о том, что, хотя ионизирующее излучение и может вызывать эффект, очень сходный с наблюдаемым в обычных условиях хранения, особенно в отношении индукции ядерных повреждений, фоновая радиация в этих условиях не может быть причиной снижения жизнеспособности. Необходимо, однако, подчеркнуть, что эти аргументы не исключают появления альтернативных теорий, объясняющих причины ядерных повреждений, но при использовании их следует указывать, что повреждения, о которых идет речь, не относятся к повреждениям, вызываемым ионизирующей радиацией.
Плесени хранения
Способность плесеней хранения ускорять гибель семян не вызывает сомнения. Это является одной из причин, почему только этой группе организмов, связанных с семенами, посвящена отдельная глава. Известно, что активность грибов усиливается с повышением температуры, влажности семян и давления кислорода. Следовательно, это объяснение потери жизнеспособности, по-видимому, совместимо с данными о влиянии факторов окружающей среды. Как указывает Кристенсен, в условиях, при которых грибы способны вызвать гибель семян, она может быть результатом либо прямого нападения патогенов, либо влияния выработанных ими токсинов. Несмотря на это, данную теорию по меньшей мере по трем причинам нельзя использовать для универсального объяснения. Во-первых, хотя есть данные, что стерильные семена дольше сохраняют жизнеспособность, чем нестерильные, они ее все-таки со временем теряют. Так, Хуммель, Кевде, Кристенсен и Геддес получили образец пшеницы, свободный от внутреннего мицелия, и подвергли его поверхностному обеззараживанию. Хотя средний период жизнеспособности не указан, его легко можно вычислить. Оказалось, что у необеззараженных семян средний период жизнеспособности был примерно на 18—23% короче, чем у обеззараженных, вероятно, вследствие наличия плесеней хранения. Во-вторых, известно, что плесени хранения при относительной влажности ниже 65% неактивны, между тем снижение жизнеспособности происходит и при более низкой влажности семян. Кроме того, при влажности семян выше и ниже критической для активности грибов наблюдается один и тот же тип зависимости между температурой, влажностью семян и снижением жизнеспособности. В-третьих, хотя парциальное давление кислорода влияет на активность грибов в семенах во время хранения и, следовательно, может косвенно воздействовать на их жизнеспособность, установлено, что кислород продолжает оказывать отрицательное влияние на жизнеспособность гороха при 60°С и влажности семян 12%, т. е. в условиях, когда грибы в семенах почти наверняка неактивны. Таким образом, мы приходим к выводу, что грибы в пределах температуры и относительной влажности, допускающих их активность, могут ускорить снижение жизнеспособности. Но в этих же пределах она продолжает снижаться и в отсутствие микроорганизмов, хотя и не так быстро. В случае, когда условия окружающей среды не допускают активности микроорганизмов, для объяснения потери жизнеспособности, очевидно, следует применять другие теории. На практике в обычных условиях коммерческого хранения семян грибы могут быть очень важным фактором, ускоряющим их порчу. В настоящее время не существует других способов борьбы с плесенями хранения, кроме регулирования условий окружающей среды. Кристенсен и Лопец суммировали результаты применения стандартных фунгицидов и пришли к выводу, что они слабо эффективны. Даже в том случае, если бы у нас появилась возможность подавлять активность грибов иными методами, чем управление условиями окружающей среды, например путем применения высокоэффективных и доступных антибиотиков, все равно долгосрочное хранение семян в типичных условиях окружающей среды оказалось бы невозможным: по-прежнему нужно было бы снижать влажность семян и температуру воздуха. Но и в этих условиях жизнеспособность семян продолжала бы, хотя и медленно, но снижаться. Поэтому при разработке систем долгосрочного хранения мы вынуждены обратиться к теориям о внутренних причинах потери жизнеспособности.
Накопление ингибиторов роста
В литературе не раз высказывалось предположение, что снижение жизнеспособности происходит вследствие накопления различного рода-токсических веществ. Щ. ограничусь здесь разбором нескольких v давно высказанных важнейших предположений, к которым время от времени возвращаются вновь. По мнению Кронера и Кар-тиса и Кларка, хотя оно и не было очень хорошо аргументировано, потеря жизнеспособности может быть обусловлена накоплением продуктов дыхания, а Виттенбах уточнил, что этим продуктом у семян Medicago sativa, Trifolium pratense и Lotus corniculatus является молочная кислота. Однако эта идея противоречит двум фактам. Во-первых, между периодом жизнеспособности и давлением кислорода существует отрицательная зависимость ; во-вторых, при измерении дыхания семян ячменя, райграса многолетнего, красного клевера, яблони и гороха во время хранения было установлено, что их ДК очень малы: в типичных случаях они меньше 0,7 и приближаются к 0,6. По данным Милнера, Кристенсена и Геддеса, метаболизм грибов на пшенице при достаточно высокой влажности семян, поддерживающей развитие плесеней, характеризуется более высоким ДК, равным 0,8. Причина обусловливающая столь низкие значения ДК хранящихся семян неясна, однако это ёще не означает, что накопление продуктов брожения может создавать трудности при хранении семян. Другой группой веществ, относительно которых высказывались предположения, являются жирные кислоты, которые накапливаются по мере снижения жизнеспособности семян. Бартон, составившая сводку материалов по этому вопросу, приходит к выводу, что даже если нередко наблюдается связь с жизнеспособностью, результаты не настолько воспроизводимы, чтобы их можно было использовать в качестве надежного показателя жизнеспособности». Есть данные, что снижение жизнеспособности семя вириса происходит в результате накопления в них индолилуксусной кислоты и других производных индола в концентрациях, превышающих оптимальные. Позднее указывалось, что накопление фенольных соединений, в том числе кумарина и феруловой кислоты, может препятствовать прорастанию семян риса. В настоящее время к этому списку ингибиторов, которые, как считается, предупреждают прорастание семян риса, относят и абсцизовую кислоту.
О важном значении температуры свидетельствуют также многочисленные исследования, показавшие, что тепловая обработка вызывает разрыв хромосом. Однако не всегда принималось во внимание, что тепловой обработкой можно считать воздействие любой температурой выше абсолютного нуля. Пето сообщает, что при экспозиции семян ячменя в течение 25 мин при 95° С или в течение 30 дней при 40° С и высокой влажности наблюдалось появление хромосомных аномалий. В ряде работ Навашина и Шкварникова на пшенице и Crepis было показано, что воздействие на свежие семена температурой 50—60° С в течение 20 дней оказало на появление хромосомных аберраций такое же влияние, как старение при комнатной температуре в течение 6—7 лет.. Сообщалось также, что повышение относительной влажности воздуха, в свою очередь, увеличивало частоту хромосомных аберраций, особенно при высоких температурах. В противоположность этому Смит указывал, что экспозиция семян зерновых культур в течение 5—15 дней при 50— 70° С или в течение 45—80 мин при 80° С практически почти не влияла на частоту хромосомных аберраций. Но за исключением работы Смита, все другие данные подтверждают точку зрения, согласно которой повреждение хромосом в семенах во время хранения может быть ускорено в результате комбинированного действия температуры, влажности семян и времени. В обычных условиях хранения в дополнение к температуре и влажности кислород также может способствовать повреждениям ядер. Однако первые данные о роли этого фактора вызывали некоторые сомнения. Шкварников сообщал, что хранение «свежих семян в течение 20 дней в атмосфере чистого углекислого газа, азота или кислорода увеличивало частоту мутаций, кроме того, он указывал, что к аналогичному результату приводило повышение или понижение содержания кислорода в воздухе. Позднее Мутшен-Дамен, Мутшен и Эренберг изучали влияние давления кислорода в 30—60 атм в течение 3—28 дней на семена конских бобов. Высокая частота разрывов вызывалась, как было доказано, именно влиянием кислорода, поскольку использование в аналогичных условиях азота практически никакого воздействия не оказывало. Джексон сообщал, что разрыв хромосом в семенах лука усиливается при хранении в среде с повышенной концентрацией кислорода. Приведенный краткий обзор показывает, что возникновение повреждений хромосом в процессе старения семян зависит, вероятно, от интеграции с течением времени воздействий температуры, влажности и кислорода. Эти три фактора в основном контролируют период жизнеспособности семян, поэтому возможно, что существует какая-то связь между накоплением повреждений хромосом и потерей жизнеспособности.
Корреляция между снижением жизнеспособности и накоплением повреждений хромосом
В настоящее время можно точно определить характер снижения жизнеспособности семян, это дает возможность подойти к исследованию зависимости между утратой жизнеспособности и накоплением повреждений хромосом с качественно новых позиций. В исследованиях, проведенных на горохе, бобах и ячмене, для обеспечения разных скоростей снижения жизнеспособности семена экспонировали при различных комбинациях температуры и влажности и через определенные промежутки времени определяли потерю жизнеспособности и накопление повреждений хромосом. Цитологические исследования проводились на первых делениях меристематических клеток кончиков корешков, образовавшихся у выживших семян, заложенных на проращивание. В предварительных опытах были изучены различные аномалии, встречающиеся во всех фазах митоза, и было установлено, что больше всего разрывов можно обнаружить в анафазе. Поэтому в каждом варианте просматривали 300 клеток находящихся в анафазе; те из них, в которых были видны мосты или фрагменты, относили к аберрантным и выражали в процентах от всех просмотренных клеток. Результаты опытов с конскими бобами представлены на рисунке 37, где показаны также кривые выживаемости для соответствующих вариантов. С первого взгляда видно, что с увеличением экспозиции повреждения хромосом усиливаются и. что если примененное воздействие приводит к быстрой потере жизнеспособности, то оно ведет и к быстрому накоплению аберраций. На рисунке 38 полученные данные нанесены на график иным способом, и из него становится ясно, что для всех вариантов опытов, кроме одного, каждому из выживших семян соответствует одна и та же средняя частота появления аберрантных клеток. Таким образом, независимо от того, какова •скорость снижения жизнеспособности и какой фактор окружающей среды его главным образом вызывает, доля аберрантных клеток у выживших экземпляров является функцией относительной жизнеспособности. Очень сходные результаты были получены для семян гороха и ячменя. Как обсуждается подробнее в других статьях, асимптотическую природу этих кривых можно объяснить тем, что семя, содержащее повреждения хромосом в количествах, превышающих критическое, становится нежизнеспособным и автоматически исключается из образца,.предназначенного для цитологического исследования. Исключение из этого правила составил у всех трех видов самый неблагоприятный вариант хранения, при котором средний период жизнеспособности составлял меньше недели. В этом случае каждому значению относительной жизнеспособности у выживших семян соответствовала меньшая частота аберрантных клеток, чем во всех других вариантах. Это свидетельствует о том, что в самых неблагоприятных условиях экспозиции может действовать какой-то дополнительный отрицательный фактор, который не находит отражения в разрывах хромосом. По-видимому, аналогичное явление наблюдал Харрисон в опытах с семенами салата. По его данным, 2—5-дневное выдерживание семян с влажностью 10% при температуре. 40° С приводило к снижению их всхожести в пределах от 65 до 6%. В этих образцах накапливалось значительно меньше анафазных аберраций, чем в семенах с такой же всхожестью, но терявших жизнеспособность медленно. Отсюда следует, что, хотя между снижением жизнеспособности и накопленнием хромосомных повреждений существует превосходная корреляция, эта взаимосвязь может нарушиться в очень неблагоприятных, условиях хранения, когда снижение жизнеспособности может оказаться сильнее, чем следовало ожидать при том количестве повреждений хромосом, которое наблюдалось после определенного периода времени. Результаты опытов, в которых скорость снижения жизнеспособности увеличивали путем повышения парциального давления кислорода, также свидетельствуют о наличии тесной корреляции между потерей жизнеспособности и частотой появления аберрантных клеток у выживших зародышей, если другие условия хранения неэкстремальны. Данные, характеризующие жизнеспособность семян и средний процент аберрантных клеток у выжившей популяции после хранения в течение 35 дней при умеренных условиях или после трехдневного хранения при очень неблагоприятных условиях. Можно видеть, что в обоих случаях повышение концентрации кислорода с 0 до 21% увеличивало скорость снижения жизнеспособности и одновременно повышало частоту появления аберрантных клеток. При более благоприятных условиях хранения цифры, характеризующие зависимость между всхожестью и частотой аберрантных клеток, очень сходны с цифрами, полученными ранее, при большинстве условий хранения. Однако, как было установлено предварительно, при очень неблагоприятных условиях хранения семена обычно погибают раньше, чем накопится определенное число разрывов хромосом. Эти результаты, в свою очередь, подчеркивают, что почти при всех условиях хранения существует весьма тесная связь между повреждением хромосом и снижением жизнеспособности независимо от того, какие факторы окружающей среды ее вызывают. Результаты некоторых работ Харрисона и Мак-Лиша по хранению семян салата в атмосфере различных газов свидетельствуют о том, что кривая, иллюстрирующая зависимость между жизнеспособностью и частотой аномальных анафаз, по существу сходна с кривой, описанной для семян гороха, бобов и ячменя. Однако максимальная частота аберраций здесь гораздо выше: при снижении жизнеспособности семян салата до 50% доля аномальных анафаз в корешках составляла почти 90%. Харрисон и Мак-Лиш исследовали также семена лука и обнаружили низкую частоту разрывов хромосом на всех уровнях всхожести, из чего они заключили, что «снижение всхожести не обязательно сопровождается повышением частоты аномальных клеток». Однако в этом опыте график был построен только по трем точкам, и наивысшая всхожесть семян была всего лишь 76%; при этой и более низкой всхожести частота аномальных анафаз составляла от 10 до 15%. Хотя эти частоты невысоки по сравнению с наблюдаемыми у салата, они близки к значениям для гороха и бобов и превышают полученные для ячменя. Поэтому, учитывая все вышесказанное-и отсутствие данных о частоте аберраций при высокой всхожести, можно сомневаться в правильности вывода об отсутствии корреляции между жизнеспособностью и частотой аберрантных клеток у лука. Об этом свидетельствуют также опыты Николса и Сакса, в которых было показано, что с удлинением периода хранения частота появления аберрантных клеток у лука увеличивается. Для подтверждения выводов, полученных на основании цитологических исследований семян гороха, бобов и ячменя, была изучена зависимость между снижением жизнеспособности, вызванным различными комбинациями температуры и влажности семян, и индукцией мутаций во время хранения. При этом применялись два метода. Первый был основан на предположении, что многие рецессивные мутации могут оказаться летальными и проявляться только в гаплоидном состоянии, соответственно была исследована абортивность пыльцы у растений Аь Второй метод основывался на возможности самоопыления растений At и исследовании потомства да присутствие рецессивных хлорофильных мутантов в поколении Аг. Для снижения жизнеспособности примерно до 50% были использованы различные комбинации трех факторов, применявшиеся в других опытах, и выжившие в этих условиях семена сравнивали с контрольными, которые хранились в- хороших условиях и сохранили первоначальную высокую жизнеспособность. На «сновании гипотезы о том, что генетические повреждения являются функцией снижения жизнеспособности, можно было ожидать, что эти варианты дадут одно и то же число мутантов. Фактически исследования были поставлены недостаточно широко, чтобы обеспечить необходимую точность испытаний, но во всяком случае можно сказать, что результаты, не противоречат этой гипотезе. На основании этих результатов можно предположить, что в большинстве условий хранения относительная жизнеспособность служит хорошим показателем наличия в выживших семенах разрыва хромосом и генной мутации независимо от того, как быстро снижается жизнеспособность и какой из факторов окружающей среды оказывает во время хранения наиболее отрицательное воздействие. В этих опытах изучали мутации относительно небольшого числа генов: только тех, которые влияли на недоразвитие пыльцы, и немногих из генов, определяющих недостаточность хлорофилла. Они, несомненно, составляют очень небольшую долю общего комплекса генов. Однако при хранении семян в условиях, приводящих к потере 50% жизнеспособности, частота мутаций генов, влияющих на образование хлорофилла, повысилась с крайне низкого уровня до 1—3%. Поэтому, вероятно, можно допустить, что общее число всех типов генных мутаций, индуцированных в популяции выживших семян, должно очень сильно повыситься. Хотя приведенные выше данные свидетельствуют о том, что генные мутации возникают в таких условиях хранения, которые приводят к снижению жизнеспособности примерно на 50%, имеется несколько прямых доказательств возникновения наследуемых мутаций при хранении семян в условиях, вызывающих только слабое снижение жизнеспособности. Калдекотт показал, что в семенах ячменя частота хлорофильных мутаций, вызванных рентгеновским облучением в анаэробных условиях, прямо пропорциональна частоте хромосомных аберраций. Таким образом, при отсутствии доказательств противного мы можем принять, что относительная жизнеспособность является хорошим показателем наследуемых генетических мутаций, возникших в выжившей популяции. Эти результаты представляют практическую ценность для лиц, имеющих отношение к хранению семян генетических линий и к проектированию систем хранения семян, речь о которых шла в главе 2. Кроме того, умышленное создание плохих условий хранения можно использовать в качестве простого метода индукции мутаций в селекционной работе. Помимо работ, где использовали нормальные условия хранения, описанные до сих пор, были проведены опыты, в которых исследовали также корреляцию между жизнеспособностью и частотой хромосомных повреждений, вызываемых искусственными средствами. Так, имеется много данных, часть которых будет рассмотрена ниже, свидетельствующих о том, что ионизирующее излучение усиливает повреждение хромосом и в то же время снижает жизнеспособность. Особенно интересно отметить, что, по данным К. Сакса и X. Сакса, нормальное старение и рентгеновское облучение синергически влияют на возникновение хромосомных аберраций. Пример другого типа проводят Додсон и Ю, которые в течение 3 или 4 ч воздействовали на семена сорго, пшеницы и овса центробежной силой. По их данным, в диапазоне 5000—25000 g наблюдается отрицательная линейная зависимость между центробежной силой и жизнеспособностью, хотя раньше эти же авторы показали, что появление хромосомных аберраций у ячменя пропорционально используемой центробежной силе и времени воздействия.
Ненаследуемые морфологические аномалии
Кроме растений с рецессивными мутациями, которые проявляются не раньше чем в поколении Аг, из старых семян очень часто образуются явно ненормальные растения в поколении Аь В опытах с семенами гороха и бобов было показано, что любые условия хранения, приводящие к значительному снижению жизнеспособности, способствуют появлению аномальных растений в Аь Частота их появления, по-видимому, не связана с относительной жизнеспособностью, но у гороха они составляли 5% по сравнению с 0 в контроле; у конских бобов — соответственно 10 и 2%. В большинстве случаев на аномальных растениях завязывались жизнеспособные семена, но ни в одном случае не было отмечено наследования аномалий, и соответственно причина их появления неизвестна. Наиболее вероятно, что они обусловлены какими-либо цитоплаз-матическими или физиологическими изменениями, а не хромосомными. Мы не будем детально останавливаться на морфологических аномалиях, появляющихся в Ai, но вкратце укажем, что к ним относятся листья ненормальной формы, пятна, свидетельствующие о недостатке хлорофилла, ненормальное ветвление. Картледж, Бартон и Блэксли обнаружили сходные аномалии у растений, развившихся из старых семян Datura. Своеобразная морфологическая аномалия — прищипнутые кончики корней — часто наблюдается у проростков, развившихся из старых семян хлопчатника. Харрисон сообщал о появлении в Ai салата карликовых и хлоротичных растений. Доля каждой аномалии варьировала в зависимости от условий хранения, и генетический статус их неизвестен.
Накопление мутагенов
Ингибиторы роста с мутагенными свойствами представляют собой особую категорию. Перед исследователями, изучавшими хромосомные аберрации и генетические мутации, сопутствующие снижению жизнеспособности, вставал вопрос, каковы же причины этих повреждений. Вероятно, мы не ошибемся, если скажем, что большинство исследователей считает, что повреждение хромосом происходит в результате накопления в семени аутомутагенных веществ.Данные, накопившиеся в дальнейшем, послужили материалом для обширной сводки, которую составили д'Амато и Хофман — Остенхоф. Они пришли к заключению, что «наиболее вероятными причинами утраты способности к прорастанию являются или летальные изменения хромосом, вызываемые аутомутагенными веществами, которые накапливаются в процессе старения семян, или более общее отравление зародыша, обусловленное накоплением аутотоксичных соединений». Джеймс полагал, что такими токсичными мутагенными веществами могут быть конечные продукты дыхания. В тех случаях, когда мутагены могут быть обнаружены, обычно трудно определить, являются они продуктами метаболизма самого семени или связанной с ними микрофлоры; исключение составляет старение семян в условиях, исключающих активность микрофлоры. В этой связи следует указать, что, как известно, некоторые продукты жизнедеятельности микрофлоры, присутствующей на семенах в период хранения, обладают мутагенными свойствами. Так, установлено, что афлатоксин вызывает в семенах Vicia faba разрывы хромосом. Поэтому в настоящее время мутагенные теории трудно разделить на внутренние и внешние. Однако большинство сторонников этой гипотезы считает, что мутагены образуются в самих семенах. Внимание исследований в данной области сосредоточено в основном на выделении и испытании мутагенных веществ. Однако многие доказательства, приведенные в основном обзоре по этому вопросу, не выдерживают критики. В некоторых случаях не испытывали контрольные экстракты из свежих семян, в то время как есть данные о наличии в них мутагенной активности; часто экстракты испытывали только на других видах, или при испытании на том же самом виде они не обладали мутагенной активностью; в ряде случае» экстракты были токсичны и обладали антимитотическими, но не мутагенными свойствами. Тем не менее, если откинуть все сомнительные факты, остается некоторое число убедительных доказательств, которые приводят ЗКиске, Хитье, Изар и Муна, обнаружившие, что масло, отжатое из старых семян табака, оказывало на тот же вид мутагенное действие, тогда как экстракты из молодых: семян такой активностью не обладали. Недавно Джексон сообщил об опыте, в котором свежие семена лука обрабатывали вытяжками из старых или свежих семян. Вытяжки из старых семян вызывали разрыв хромосом. В опыте отсутствовал статистический контроль, поэтому эти результаты следует расценивать как предварительные. В недавних опытах с семенами гороха, бобов и ячменя не было обнаружено никакой мутагенной активности. Исследовали водный,.этанольный и эфирный экстракты, а также вытяжки, приготовленные по методу Джексона. Хотя водные экстракты и обладали способностью ингибировать рост, никаких различий между экстрактами из свежих семян и из семян, потерявших 50% жизнеспособности в результате двух вариантов искусственного старения, обнаружено не было. В опытах с взаимной пересадкой молодых и старых зародышей и эндоспермов Triticum durum, которые провел Флорис, были получены следующие результаты: при пересадке молодого зародыша на молодой эндосперм всхожесть составила 94%; молодого зародыша на старый эндосперм — 76%; старого зародыша на молодой эндосперм—13%; старого зародыша на старый эндосперм—18%. Различия между двумя последними цифрами недостоверны, но между двумя первыми разница вполне достоверна и показывает, что ингибиторы, накапливающиеся в эндосперме, могут подавлять прорастание. В ходе дальнейших исследований было показано, что эндосперм семян, хранившихся до четырех лет в лаборатории, не оказывал существенного влияния на прорастание пересаженных на них : молодых зародышей, хотя некоторое подавление роста проростков наблюдалось. Жизнеспособность четырехлетних зародышей составляла 31%. Однако пятилетние эндоспермы с примерно такой же жизнеспособностью подавляли прорастание молодых зародышей, с которыми были соединены, снижая прорастание с 90% для молодых гомотрансплантатов до 53% У гетеротрансплантатов — старых зародышей, пересаженных на молодые эндоспермы. Поэтому данные опыты показывают, что ингибиторы прорастания, образующиеся в эндосперме, могут значительно подавлять прорастание в условиях, вызывающих существенное снижение жизнеспособности. Проведя сходные опыты с пересадкой, Кореи и Аванци пришли к выводу, что вызванное старением повреждение хромосом у зародыша не является результатом старения эндосперма, хотя он и может обусловливать незначительный уровень хромосомных повреждении. В этом контексте интересно отметить, что мутагенный эффект эндосперма, облученного рентгеновскими лучами, передается гораздо сильнее, что еще раз подчеркивает упоминавшуюся :выше разницу между воздействием облучения и явлением естественного старения.
Повреждение цитоплазматических органелл
Хотя уже давно известно, что снижение жизнеспособности связано с накоплением ядерных повреждений, данные о повреждении цитоплазматических органелл еще только начали появляться. Это объясняется тем фактом, что получение прямых доказательств повреждения внеядерных органелл стало возможным лишь после того, как биологи начали использовать в своих исследованиях электронный микроскоп. Абу-Шакра и Чинг исследовали активность митохондрий в двух образцах семян сои ; возраст одного из них составлял несколько месяцев, а другого — три года. Оба хранились в сухих условиях при комнатной температуре. Хотя семена во втором образце были гораздо старше, чем в первом, всхожесть и тех, и других превышала 80%. Однако скорость роста проростков, образовавшихся из более старых семян, была значительно ниже. Опыт проводили на митохондриях, выделенных из осей проростков через четыре дня после того, как семена были заложены на проращивание. Хотя скорость поглощения кислорода в обоих вариантах была примерно одинакова, митохондрии из свежих семян этерифи-цировали в два с лишним раза больше неорганического фосфата, чем митохондрии из старых семян; отношение Р/О составляло соот-ветственно 3,0 и 1,4. Это свидетельствует о том, что в митохондриях из старых семян, нарушено сопряжение. Электронные микрофотографии показали, что митохондриальная фракция, выделенная из молодых семян, содержит интактные и вздутые митохондрии, а также пластиды и пузырьки. Аналогичная фракция из старых семян содержала митохондрии с расширенными или вздутыми кристами и коагулированным матриксом, у некоторых из них отсутствовала интактная наружная мембрана. Абу-Шакра и Чинг полагали, что эти морфологические особенности могут и не быть причиной отсутствия эффективности, так как такие же признаки были обнаружены у функционирующих митохондрий, выделенных из Другого растительного материала. Тем не менее уплотнение матрикса является отличительной чертой митохондрий из старых семян. Эти авторы сообщали также, что число митохондрий на проросток в старой ткани было, по-видимому, ниже, чем в новой. Однако без дополнительных исследований трудно установить, являются эти количественные различия функцией возраста семян или скорости роста проростка. Для более достоверного распознавания возможных морфологических различий Абу-Шакра и Чинг предложили проводить исследования in situ. Бержак и Вилье использовали этот метод при изучении семян кукурузы. В серии опытов они изучали также изменения, происходящие во всех других различимых клеточных органеллах. В ходе этих исследований сравнивали семена кукурузы, не подвергавшиеся старению, и семена с влажностью 14%, экспонировавшиеся до 34 дней при 40° С. В этих условиях средний период жизнеспособности составлял около 18 дней, а к 30-му дню она полностью утрачивалась. Изучение давленых препаратов корешков подтвердило, что накопление хромосомных аберраций до некоторой степени напоминало процесс, уже описанный для гороха, бобов и ячменя. Кроме того, кривая, отражающая зависимость между процентом жизнеспособности и процентом аберрантных клеток в выживших семенах, относилась по существу к тому же типу, что и кривая, которую приводят Абдалла и Роберте. У кукурузы относительное число аберрантных конфигураций в анафезе возрастало, асимптотически приближаясь к 9%. Наблюдения за ядром проводились под световым микроскопом, изучение же цитоплазматических органелл было проведено Бержак при помощи электронного микроскопа. Семена, используемые для этих наблюдений, замачивали в воде при 25° С на 12, 24 и 48 ч. Хотя некоторые наблюдения проводились на цельных кончиках корней, детальные исследования были ограничены корневым чехликом, поскольку это давало возможность изучить два различных процесса старения. Первый процесс представляет собой организованное старение клеток корневого чехлика по мере их удаления от калиптрогена. Он происходит во время роста корня и необходим для эффективного функционирования корневого чехлика, которое, как показали наблюдения Бержак, характеризуется повышенной секреторной активностью диктиосом и выделением лизосомных ферментов. Предполагается, что этот тип старения запрограммирован генетически. Но в настоящей книге мы в основном уделяем внимание второму процессу старения, который можно наблюдать в клетках корневого чехлика, т. е. незапрограммированным изменениям, происходящим в хранящихся семенах. При изучении ультраструктуры корневых чехликов семян, которые старели в течение 18—20 дней, были обнаружены разнообразные дегенеративные изменения. По интенсивности происходящих в семенах изменений зародыши были разделены на типы 1, 2 и 3 в порядке усиления серьезности повреждения. Старение коснулось всех органелл, но у зародышей типа 1 повреждения были в значительной мере обратимы: аномалии, появившиеся после набухания семян в течение 12 ч, через 24 или 48 ч нередко исчезали, по-видимому, в результате действия репарационных механизмов. Но у зародышей типов 2 и 3 повреждения в большинстве случаев оказывались необратимыми. Зародыши типа 3 и, вероятно, типа 2 почти несомненно нежизнеспособны. В контроле наблюдались типичные особенности ультраструктуры клеток корневого чехлика. С увеличением возраста семян усиливается тенденция к разделению ядра на лопасти. В то же время хроматин становится более восприимчивым к окрашиванию перманганатом калия. Среди органелл одними из первых претерпевают изменения пластиды, что выражается в деформации внутренней и наружной мембран, сопровождающейся вздутием органелл и уменьшением плотности матрикса. Дегенерация диктиосом начинается с разъединения цистерн, за которым следует их исчезновение. Происходит деформация контуров эндоплазматической сети, первые признаки которой появляются прежде всего в клетках чех-лика и выражаются в увеличении диаметра просветов цистерн; по мере дальнейшего старения контуры ЭС становятся длиннее и тоньше, часто наблюдается значительная гипертрофия; в конце концов у зародышей типа 3 сохраняются только короткие раздутые контуры. В нестаром материале образование полисом становится заметным через 12 ч после начала набухания, но у зародышей старых семян рибосомы на этой стадии набухания по-прежнему в значительной степени разъединены. Считают, что это изменение является скорее результатом замедления метаболизма, чем разрушения иРНК. У зародышей типа 3 на любой стадии видны только моносомы. Как и пластиды, митохондрии относятся к органеллам, которые первыми претерпевают изменения, связанные с возрастом. Их форма становится неправильной, и кроме того, бывает ясно заметна дезорганизация внутренней мембраны, особенно в зоне зрелых клеток; нередко в них возникает своеобразное внутреннее пространство, ограниченное мембраной. У зародышей типа 3 наблюдаются признаки экстремальной дегенерации: митохондрии отличаются слабо выраженной внутренней структурой, и наблюдающаяся на ранних стадиях деформация мембран, по-видимому, исчезает, поскольку органеллы набухают, вероятно, вследствие потери контроля за переносом электронов и одновременного уменьшения плотности матрикса. На промежуточных стадиях старения наблюдается преждевременное развитие лизосом, так что в зонах деления и дифференциации клеток обнаруживаются лизосомы второй фазы. В лизосомных вакуолях часто встречаются остатки митохондрий и пластид. У зародышей типа 3 лизосомы набухают и ограничивающие их мембраны часто кажутся дефектными; при удлинении периода набухания начинается общий распад органелл, и интактных лизосом видно мало. Их исчезновение подтверждается тем фактом, что на этой стадии в протоплазме распространяется кислая фосфатаза. Возможно, что практически все описанные дегенеративные изменения ультраструктуры являются результатом общего повреждения липопротеиновых клеточных мембран. Если ухудшение последних не зашло очень далеко, по-видимому, возможно частичное их восстановление. В противном случае дезорганизация клетки становится необратимой. Это предположение основано на некоторых данных, показывающих, что ЭС до некоторой степени может быть связана с газообменом, поскольку было установлено, что пролиферация ЭС наблюдается в растительных клетках при низких давлениях кислорода и у штаммов дрожжей, лишенных митохондрий. Если повреждение митохондрий является первым звеном в процессе ухудшения семян, можно ожидать, что по мере снижения жизнеспособности будет наблюдаться некоторое ослабление интенсивности дыхания семян, заложенных на проращивание. Тронберри и Смит сообщали о таком снижении у семян кукурузы, но корреляция с потерей жизнеспособности была в этом случае далеко не безупречной. Однако можно согласиться, что если вышеупомянутые компенсирующие механизмы действительно существуют, то, используя простые методы измерения дыхания, можно просто не зафиксировать снижения интенсивности митохондриального дыхания. Но если они отсутствуют, то экспериментально обнаруженные небольшие различия в потреблении кислорода между старыми и новыми семенами ячменя и пшеницы явно противоречат высказанному Бержак предположению о том, что повреждение митохондрий может быть главным фактором, предотвращающим прорастание старых семян. Нарушением целостности мембран по мере старения, видимо, можно объяснить тот факт, что из старых семян в среду, на которой проводится проращивание, выделяется больше метаболитов, чем из свежих. Это явление известно уже в течение некоторого времени, но одно из самых обширных исследований по этому вопросу принадлежит Чингу и Скулкрафту, которые сравнивали семена райграса и красного клевера, хранившиеся в различных условиях в течение десяти лет. Они показали, что существует некоторая корреляция, хотя и не безупречная, между снижением жизнеспособности, электропроводностью экстрактов из семян красного клевера и концентрацией в них Сахаров и аминокислот. Но у райграса корреляция с электропроводностью или концентрацией Сахаров была выражена очень слабо, а с концентрацией аминокислот несколько лучше. В главе 7 указано, что Такаянаги и Мураками разработали простые методы определения жизнеспособности на основе концентрации Сахаров в экстрактах из семян. Однако Абдул-Баки и Андерсон подвергли сомнению обоснованность такого метода испытаний по крайней мере для ячменя, обнаружив, что в быстро стареющих семенах эта корреляция нарушалась. Кроме того, несомненный интерес для настоящей дискуссии представляет их предположение о том, что концентрация глюкозы в экстракте скорее связана с концентрацией этого вещества в семени и поэтому может и не являться показателем целостности мембраны. Бержак и Вилье использовали метод радиоавтографии для изучения характера включения 3Н-тимидина во время четырехчасовой инкубации в конце 48-часового периода набухания. Эти опыты показали, что включение ограничивалось ядрами меристематической зоны чехлика, что указывает на репликацию в них ДНК. Доля меченых ядер составила 6% на чехлик. Но в зародышах семян, подвергавшихся искусственному старению в течение 10—14 дней, доля меченых ядер возрастала примерно до 8,5%. Это увеличение было обусловлено по крайней мере частично включением метки в клетках зон, которые в нормальном состоянии не являются меристематическими. При удлинении периода искусственного старения до 18—20 дней доля клеток чехлика с мечеными ядрами составляла менее 1%. В этих случаях включение носило случайный характер и редко происходило в зоне инициальных клеток или в зоне деления. Бержак и Вилье предложили два объяснения этого положения. Во-первых, это может означать, что мери-стематические клетки более чувствительны к повреждениям, происходящим в процессе старения, и замещаются клетками, обычно находящимися в покое и, как можно предполагать, менее подверженными повреждениям. По-видимому, это явление аналогично положению, когда клетки покоящегося центра меристемы корня начинают делиться после облучения рентгеновскими лучами и замещают поврежденные клетки меристемы. Во-вторых, это может свидетельствовать о повреждении репрессорных механизмов, ингибирующих репликацию ДНК в немеристематических клетках. Из приведенной дискуссии видно, что в настоящее время имеется много данных, которые показывают, что потере жизнеспособности семени предшествует возрастание повреждении практически всех клеточных органелл как в ядре, так и в цитоплазме. При повреждении ядер, за исключением крайне неблагоприятных условий хранения, наблюдается хорошая корреляция между степенью повреждений и потерей жизнеспособности независимо от того, как быстро снижалась жизнеспособность или какие факторы окружающей среды ее в основном вызывали. Эти обобщения справедливы для всех детально изученных видов. Теперь необходимо распространить эти исследования на другие виды и выяснить, какие изменения цитоплазматических органелл происходят при старении семян с различной скоростью и в разных условиях. Подобные работы помогут установить, какие изменения имеют наиболее важное значение. Андерсон, Бекер и Уортингтон опубликовали короткую статью, посвященную изменениям ультраструктуры в осях зародышей пшеницы в процессе хранения. Они сравнивали семена пшеницы, зараженные присущей им микрофлорой и хранившиеся 26 недель при 25°С и относительной влажности 75%, с контрольными семенами, хранившимися при —20°С. Были отмечены различные аномалии, в том числе изменения, которые интерпретировались как слипание липидных телец, отделение плазмалеммы от клеточных стенок и разрыв плазмалеммы. Они предполагали, что эти изменения явились результатом деятельности грибов, но, поскольку ее наличие и отсутствие нельзя отделить от влияния условий хранения, принять с уверенностью их интерпретацию пока невозможно, так как эти изменения могли быть результатом более прямого влияния условий хранения на клеточные органеллы. В дальнейшей работе необходимо разграничить непосредственное воздействие окружающей среды и возможное косвенное влияние микрофлоры на повреждение клеточных органелл. Хотя настоящий обзор посвящен главным образом нормальным семенам, жизнеспособность которых была повышена путем снижения их влажности, необходимо упомянуть, что у семян с довольно высокой оптимальной влажностью с потерей жизнеспособности могут быть связаны совершенно иные цитологические факторы. Например, Генкель и Ши-Хсу связывали снижение жизнеспособности семян кофейного дерева с распадом плазмодесм.
Теории жизнеспособности
Кроме сведений о генетических и цитологических изменениях, происходящих в семенах во время хранения, имеется много данных о разнообразных метаболических различиях между молодыми и старыми семенами. Мы не стремимся дать их полный перечень. Следует отметить, что в большинстве случаев не было обнаружено тесной корреляции между различиями, связанными с возрастом, и снижением жизнеспособности. В настоящей главе речь будет идти лишь о тех изменениях, которые используются в некоторых теориях, предложенных для объяснения потери жизнеспособности. Более подробные сведения по этому вопросу можно найти в других обзорах. Мы до сих" пор не знаем, почему семена теряют жизнеспособность, но недостатка в теориях по этому вопросу не ощущаем. Я попытался классифицировать важнейшие из них на рисунке 53, из которого видно, что теории жизнеспособности удобно разделить на две группы. Авторы теорий первой группы предполагают, что гибель семян происходит в результате воздействия внешних факторов; авторы теорий второй группы считают, что гибель наступает в результате процессов, происходящих в самих семенах. Оба типа могут до некоторой степени перекрывать друг друга. Так, согласно теории, нашедшей довольно широкую поддержку, потеря жизнеспособности является результатом повреждения ядер, но последнее может происходить вследствие как внутренних, так и внешних событий.
Ионизирующее излучение
Неоднократно высказывалось предположение, что в обычных условиях хранения снижение жизнеспособности может быть вызвано вредоносным действием фоновой ионизирующей радиации. Эта мысль основана на общеизвестном факте, что применение повышенных доз радиации может ускорить потерю жизнеспособности семян и старение других организмов. Кроме того, ионизирующая радиация вызывает появление мутаций и хромосомных аномалий, которые, как мы видели, тесно связаны со снижением жизнеспособности семян. Тем не менее существуют по крайней мере три веских аргумента в пользу того, что фоновая радиация не может играть важную роль при нормальных условиях хранения. Во-первых, имеется много данных, что в смысле снижения жизнеспособности и ослабления роста проростков или индукции рецессивных мутантных фенотипов ионизирующее излучение сильнее повреждает диплоидные виды, чем полиплоидные, в то время как Смит указывал, что в немногих исследованиях, посвященных долговечности полиплоидных и диплоидных семян, нет никаких указаний на благотворное влияние полиплоидии. Отсюда следует, что при нормальных условиях снижение жизнеспособности обусловлено не радиацией. Во-вторых, было показано, что вредное Действие рентгеновских лучей на семена ячменя, определяемое по характеру развития проростков или по появлению хромосомных аберраций, усиливается при понижении влажности семян, в то время как установлено, что в обычных условиях хранения ядерные повреждения и потеря жизнеспособности при уменьшении влажности семян ослабевают. В-третьих, экстраполяция экспериментальных кривых доза — реакция от ионизирующей радиации к фоновому уровню показывает, что последний не мог быть причиной снижения жизнеспособности, наблюдающегося при многих обстоятельствах. Эти аргументы свидетельствуют о том, что, хотя ионизирующее излучение и может вызывать эффект, очень сходный с наблюдаемым в обычных условиях хранения, особенно в отношении индукции ядерных повреждений, фоновая радиация в этих условиях не может быть причиной снижения жизнеспособности. Необходимо, однако, подчеркнуть, что эти аргументы не исключают появления альтернативных теорий, объясняющих причины ядерных повреждений, но при использовании их следует указывать, что повреждения, о которых идет речь, не относятся к повреждениям, вызываемым ионизирующей радиацией.
Плесени хранения
Способность плесеней хранения ускорять гибель семян не вызывает сомнения. Это является одной из причин, почему только этой группе организмов, связанных с семенами, посвящена отдельная глава. Известно, что активность грибов усиливается с повышением температуры, влажности семян и давления кислорода. Следовательно, это объяснение потери жизнеспособности, по-видимому, совместимо с данными о влиянии факторов окружающей среды. Как указывает Кристенсен, в условиях, при которых грибы способны вызвать гибель семян, она может быть результатом либо прямого нападения патогенов, либо влияния выработанных ими токсинов. Несмотря на это, данную теорию по меньшей мере по трем причинам нельзя использовать для универсального объяснения. Во-первых, хотя есть данные, что стерильные семена дольше сохраняют жизнеспособность, чем нестерильные, они ее все-таки со временем теряют. Так, Хуммель, Кевде, Кристенсен и Геддес получили образец пшеницы, свободный от внутреннего мицелия, и подвергли его поверхностному обеззараживанию. Хотя средний период жизнеспособности не указан, его легко можно вычислить. Оказалось, что у необеззараженных семян средний период жизнеспособности был примерно на 18—23% короче, чем у обеззараженных, вероятно, вследствие наличия плесеней хранения. Во-вторых, известно, что плесени хранения при относительной влажности ниже 65% неактивны, между тем снижение жизнеспособности происходит и при более низкой влажности семян. Кроме того, при влажности семян выше и ниже критической для активности грибов наблюдается один и тот же тип зависимости между температурой, влажностью семян и снижением жизнеспособности. В-третьих, хотя парциальное давление кислорода влияет на активность грибов в семенах во время хранения и, следовательно, может косвенно воздействовать на их жизнеспособность, установлено, что кислород продолжает оказывать отрицательное влияние на жизнеспособность гороха при 60°С и влажности семян 12%, т. е. в условиях, когда грибы в семенах почти наверняка неактивны. Таким образом, мы приходим к выводу, что грибы в пределах температуры и относительной влажности, допускающих их активность, могут ускорить снижение жизнеспособности. Но в этих же пределах она продолжает снижаться и в отсутствие микроорганизмов, хотя и не так быстро. В случае, когда условия окружающей среды не допускают активности микроорганизмов, для объяснения потери жизнеспособности, очевидно, следует применять другие теории. На практике в обычных условиях коммерческого хранения семян грибы могут быть очень важным фактором, ускоряющим их порчу. В настоящее время не существует других способов борьбы с плесенями хранения, кроме регулирования условий окружающей среды. Кристенсен и Лопец суммировали результаты применения стандартных фунгицидов и пришли к выводу, что они слабо эффективны. Даже в том случае, если бы у нас появилась возможность подавлять активность грибов иными методами, чем управление условиями окружающей среды, например путем применения высокоэффективных и доступных антибиотиков, все равно долгосрочное хранение семян в типичных условиях окружающей среды оказалось бы невозможным: по-прежнему нужно было бы снижать влажность семян и температуру воздуха. Но и в этих условиях жизнеспособность семян продолжала бы, хотя и медленно, но снижаться. Поэтому при разработке систем долгосрочного хранения мы вынуждены обратиться к теориям о внутренних причинах потери жизнеспособности.
Накопление ингибиторов роста
В литературе не раз высказывалось предположение, что снижение жизнеспособности происходит вследствие накопления различного рода-токсических веществ. Щ. ограничусь здесь разбором нескольких v давно высказанных важнейших предположений, к которым время от времени возвращаются вновь. По мнению Кронера и Кар-тиса и Кларка, хотя оно и не было очень хорошо аргументировано, потеря жизнеспособности может быть обусловлена накоплением продуктов дыхания, а Виттенбах уточнил, что этим продуктом у семян Medicago sativa, Trifolium pratense и Lotus corniculatus является молочная кислота. Однако эта идея противоречит двум фактам. Во-первых, между периодом жизнеспособности и давлением кислорода существует отрицательная зависимость ; во-вторых, при измерении дыхания семян ячменя, райграса многолетнего, красного клевера, яблони и гороха во время хранения было установлено, что их ДК очень малы: в типичных случаях они меньше 0,7 и приближаются к 0,6. По данным Милнера, Кристенсена и Геддеса, метаболизм грибов на пшенице при достаточно высокой влажности семян, поддерживающей развитие плесеней, характеризуется более высоким ДК, равным 0,8. Причина обусловливающая столь низкие значения ДК хранящихся семян неясна, однако это ёще не означает, что накопление продуктов брожения может создавать трудности при хранении семян. Другой группой веществ, относительно которых высказывались предположения, являются жирные кислоты, которые накапливаются по мере снижения жизнеспособности семян. Бартон, составившая сводку материалов по этому вопросу, приходит к выводу, что даже если нередко наблюдается связь с жизнеспособностью, результаты не настолько воспроизводимы, чтобы их можно было использовать в качестве надежного показателя жизнеспособности». Есть данные, что снижение жизнеспособности семя вириса происходит в результате накопления в них индолилуксусной кислоты и других производных индола в концентрациях, превышающих оптимальные. Позднее указывалось, что накопление фенольных соединений, в том числе кумарина и феруловой кислоты, может препятствовать прорастанию семян риса. В настоящее время к этому списку ингибиторов, которые, как считается, предупреждают прорастание семян риса, относят и абсцизовую кислоту.
