Повреждение цитоплазматических органелл
Хотя скорость поглощения кислорода в обоих вариантах была примерно одинакова, митохондрии из свежих семян этерифи-цировали в два с лишним раза больше неорганического фосфата, чем митохондрии из старых семян; отношение Р/О составляло соот-ветственно 3,0 и 1,4. Это свидетельствует о том, что в митохондриях из старых семян, нарушено сопряжение. Электронные микрофотографии показали, что митохондриальная фракция, выделенная из молодых семян, содержит интактные и вздутые митохондрии, а также пластиды и пузырьки. Аналогичная фракция из старых семян содержала митохондрии с расширенными или вздутыми кристами и коагулированным матриксом, у некоторых из них отсутствовала интактная наружная мембрана. Абу-Шакра и Чинг полагали, что эти морфологические особенности могут и не быть причиной отсутствия эффективности, так как такие же признаки были обнаружены у функционирующих митохондрий, выделенных из Другого растительного материала. Тем не менее уплотнение матрикса является отличительной чертой митохондрий из старых семян. Эти авторы сообщали также, что число митохондрий на проросток в старой ткани было, по-видимому, ниже, чем в новой. Однако без дополнительных исследований трудно установить, являются эти количественные различия функцией возраста семян или скорости роста проростка. Для более достоверного распознавания возможных морфологических различий Абу-Шакра и Чинг предложили проводить исследования in situ. Бержак и Вилье использовали этот метод при изучении семян кукурузы. В серии опытов они изучали также изменения, происходящие во всех других различимых клеточных органеллах. В ходе этих исследований сравнивали семена кукурузы, не подвергавшиеся старению, и семена с влажностью 14%, экспонировавшиеся до 34 дней при 40° С. В этих условиях средний период жизнеспособности составлял около 18 дней, а к 30-му дню она полностью утрачивалась. Изучение давленых препаратов корешков подтвердило, что накопление хромосомных аберраций до некоторой степени напоминало процесс, уже описанный для гороха, бобов и ячменя. Кроме того, кривая, отражающая зависимость между процентом жизнеспособности и процентом аберрантных клеток в выживших семенах, относилась по существу к тому же типу, что и кривая, которую приводят Абдалла и Роберте. У кукурузы относительное число аберрантных конфигураций в анафезе возрастало, асимптотически приближаясь к 9%. Наблюдения за ядром проводились под световым микроскопом, изучение же цитоплазматических органелл было проведено Бержак при помощи электронного микроскопа. Семена, используемые для этих наблюдений, замачивали в воде при 25° С на 12, 24 и 48 ч. Хотя некоторые наблюдения проводились на цельных кончиках корней, детальные исследования были ограничены корневым чехликом, поскольку это давало возможность изучить два различных процесса старения. Первый процесс представляет собой организованное старение клеток корневого чехлика по мере их удаления от калиптрогена. Он происходит во время роста корня и необходим для эффективного функционирования корневого чехлика, которое, как показали наблюдения Бержак, характеризуется повышенной секреторной активностью диктиосом и выделением лизосомных ферментов. Предполагается, что этот тип старения запрограммирован генетически. Но в настоящей книге мы в основном уделяем внимание второму процессу старения, который можно наблюдать в клетках корневого чехлика, т. е. незапрограммированным изменениям, происходящим в хранящихся семенах. При изучении ультраструктуры корневых чехликов семян, которые старели в течение 18—20 дней, были обнаружены разнообразные дегенеративные изменения. По интенсивности происходящих в семенах изменений зародыши были разделены на типы 1, 2 и 3 в порядке усиления серьезности повреждения. Старение коснулось всех органелл, но у зародышей типа 1 повреждения были в значительной мере обратимы: аномалии, появившиеся после набухания семян в течение 12 ч, через 24 или 48 ч нередко исчезали, по-видимому, в результате действия репарационных механизмов. Но у зародышей типов 2 и 3 повреждения в большинстве случаев оказывались необратимыми. Зародыши типа 3 и, вероятно, типа 2 почти несомненно нежизнеспособны. В контроле наблюдались типичные особенности ультраструктуры клеток корневого чехлика. С увеличением возраста семян усиливается тенденция к разделению ядра на лопасти. В то же время хроматин становится более восприимчивым к окрашиванию перманганатом калия. Среди органелл одними из первых претерпевают изменения пластиды, что выражается в деформации внутренней и наружной мембран, сопровождающейся вздутием органелл и уменьшением плотности матрикса. Дегенерация диктиосом начинается с разъединения цистерн, за которым следует их исчезновение. Происходит деформация контуров эндоплазматической сети, первые признаки которой появляются прежде всего в клетках чех-лика и выражаются в увеличении диаметра просветов цистерн; по мере дальнейшего старения контуры ЭС становятся длиннее и тоньше, часто наблюдается значительная гипертрофия; в конце концов у зародышей типа 3 сохраняются только короткие раздутые контуры. В нестаром материале образование полисом становится заметным через 12 ч после начала набухания, но у зародышей старых семян рибосомы на этой стадии набухания по-прежнему в значительной степени разъединены. Считают, что это изменение является скорее результатом замедления метаболизма, чем разрушения иРНК. У зародышей типа 3 на любой стадии видны только моносомы. Как и пластиды, митохондрии относятся к органеллам, которые первыми претерпевают изменения, связанные с возрастом. Их форма становится неправильной, и кроме того, бывает ясно заметна дезорганизация внутренней мембраны, особенно в зоне зрелых клеток; нередко в них возникает своеобразное внутреннее пространство, ограниченное мембраной. У зародышей типа 3 наблюдаются признаки экстремальной дегенерации: митохондрии отличаются слабо выраженной внутренней структурой, и наблюдающаяся на ранних стадиях деформация мембран, по-видимому, исчезает, поскольку органеллы набухают, вероятно, вследствие потери контроля за переносом электронов и одновременного уменьшения плотности матрикса. На промежуточных стадиях старения наблюдается преждевременное развитие лизосом, так что в зонах деления и дифференциации клеток обнаруживаются лизосомы второй фазы. В лизосомных вакуолях часто встречаются остатки митохондрий и пластид. У зародышей типа 3 лизосомы набухают и ограничивающие их мембраны часто кажутся дефектными; при удлинении периода набухания начинается общий распад органелл, и интактных лизосом видно мало. Их исчезновение подтверждается тем фактом, что на этой стадии в протоплазме распространяется кислая фосфатаза. Возможно, что практически все описанные дегенеративные изменения ультраструктуры являются результатом общего повреждения липопротеиновых клеточных мембран. Если ухудшение последних не зашло очень далеко, по-видимому, возможно частичное их восстановление. В противном случае дезорганизация клетки становится необратимой. Это предположение основано на некоторых данных, показывающих, что ЭС до некоторой степени может быть связана с газообменом, поскольку было установлено, что пролиферация ЭС наблюдается в растительных клетках при низких давлениях кислорода и у штаммов дрожжей, лишенных митохондрий. Если повреждение митохондрий является первым звеном в процессе ухудшения семян, можно ожидать, что по мере снижения жизнеспособности будет наблюдаться некоторое ослабление интенсивности дыхания семян, заложенных на проращивание. Тронберри и Смит сообщали о таком снижении у семян кукурузы, но корреляция с потерей жизнеспособности была в этом случае далеко не безупречной. Однако можно согласиться, что если вышеупомянутые компенсирующие механизмы действительно существуют, то, используя простые методы измерения дыхания, можно просто не зафиксировать снижения интенсивности митохондриального дыхания. Но если они отсутствуют, то экспериментально обнаруженные небольшие различия в потреблении кислорода между старыми и новыми семенами ячменя и пшеницы явно противоречат высказанному Бержак предположению о том, что повреждение митохондрий может быть главным фактором, предотвращающим прорастание старых семян. Нарушением целостности мембран по мере старения, видимо, можно объяснить тот факт, что из старых семян в среду, на которой проводится проращивание, выделяется больше метаболитов, чем из свежих. Это явление известно уже в течение некоторого времени, но одно из самых обширных исследований по этому вопросу принадлежит Чингу и Скулкрафту, которые сравнивали семена райграса и красного клевера, хранившиеся в различных условиях в течение десяти лет. Они показали, что существует некоторая корреляция, хотя и не безупречная, между снижением жизнеспособности, электропроводностью экстрактов из семян красного клевера и концентрацией в них Сахаров и аминокислот. Но у райграса корреляция с электропроводностью или концентрацией Сахаров была выражена очень слабо, а с концентрацией аминокислот несколько лучше. В главе 7 указано, что Такаянаги и Мураками разработали простые методы определения жизнеспособности на основе концентрации Сахаров в экстрактах из семян. Однако Абдул-Баки и Андерсон подвергли сомнению обоснованность такого метода испытаний по крайней мере для ячменя, обнаружив, что в быстро стареющих семенах эта корреляция нарушалась. Кроме того, несомненный интерес для настоящей дискуссии представляет их предположение о том, что концентрация глюкозы в экстракте скорее связана с концентрацией этого вещества в семени и поэтому может и не являться показателем целостности мембраны. Бержак и Вилье использовали метод радиоавтографии для изучения характера включения 3Н-тимидина во время четырехчасовой инкубации в конце 48-часового периода набухания. Эти опыты показали, что включение ограничивалось ядрами меристематической зоны чехлика, что указывает на репликацию в них ДНК. Доля меченых ядер составила 6% на чехлик. Но в зародышах семян, подвергавшихся искусственному старению в течение 10—14 дней, доля меченых ядер возрастала примерно до 8,5%. Это увеличение было обусловлено по крайней мере частично включением метки в клетках зон, которые в нормальном состоянии не являются меристематическими. При удлинении периода искусственного старения до 18—20 дней доля клеток чехлика с мечеными ядрами составляла менее 1%. В этих случаях включение носило случайный характер и редко происходило в зоне инициальных клеток или в зоне деления. Бержак и Вилье предложили два объяснения этого положения. Во-первых, это может означать, что мери-стематические клетки более чувствительны к повреждениям, происходящим в процессе старения, и замещаются клетками, обычно находящимися в покое и, как можно предполагать, менее подверженными повреждениям. По-видимому, это явление аналогично положению, когда клетки покоящегося центра меристемы корня начинают делиться после облучения рентгеновскими лучами и замещают поврежденные клетки меристемы. Во-вторых, это может свидетельствовать о повреждении репрессорных механизмов, ингибирующих репликацию ДНК в немеристематических клетках. Из приведенной дискуссии видно, что в настоящее время имеется много данных, которые показывают, что потере жизнеспособности семени предшествует возрастание повреждении практически всех клеточных органелл как в ядре, так и в цитоплазме. При повреждении ядер, за исключением крайне неблагоприятных условий хранения, наблюдается хорошая корреляция между степенью повреждений и потерей жизнеспособности независимо от того, как быстро снижалась жизнеспособность или какие факторы окружающей среды ее в основном вызывали. Эти обобщения справедливы для всех детально изученных видов. Теперь необходимо распространить эти исследования на другие виды и выяснить, какие изменения цитоплазматических органелл происходят при старении семян с различной скоростью и в разных условиях. Подобные работы помогут установить, какие изменения имеют наиболее важное значение. Андерсон, Бекер и Уортингтон опубликовали короткую статью, посвященную изменениям ультраструктуры в осях зародышей пшеницы в процессе хранения. Они сравнивали семена пшеницы, зараженные присущей им микрофлорой и хранившиеся 26 недель при 25°С и относительной влажности 75%, с контрольными семенами, хранившимися при —20°С. Были отмечены различные аномалии, в том числе изменения, которые интерпретировались как слипание липидных телец, отделение плазмалеммы от клеточных стенок и разрыв плазмалеммы. Они предполагали, что эти изменения явились результатом деятельности грибов, но, поскольку ее наличие и отсутствие нельзя отделить от влияния условий хранения, принять с уверенностью их интерпретацию пока невозможно, так как эти изменения могли быть результатом более прямого влияния условий хранения на клеточные органеллы. В дальнейшей работе необходимо разграничить непосредственное воздействие окружающей среды и возможное косвенное влияние микрофлоры на повреждение клеточных органелл. Хотя настоящий обзор посвящен главным образом нормальным семенам, жизнеспособность которых была повышена путем снижения их влажности, необходимо упомянуть, что у семян с довольно высокой оптимальной влажностью с потерей жизнеспособности могут быть связаны совершенно иные цитологические факторы. Например, Генкель и Ши-Хсу связывали снижение жизнеспособности семян кофейного дерева с распадом плазмодесм.
Кроме сведений о генетических и цитологических изменениях, происходящих в семенах во время хранения, имеется много данных о разнообразных метаболических различиях между молодыми и старыми семенами. Мы не стремимся дать их полный перечень. Следует отметить, что в большинстве случаев не было обнаружено тесной корреляции между различиями, связанными с возрастом, и снижением жизнеспособности. В настоящей главе речь будет идти лишь о тех изменениях, которые используются в некоторых теориях, предложенных для объяснения потери жизнеспособности. Более подробные сведения по этому вопросу можно найти в других обзорах. Мы до сих пор не знаем, почему семена теряют жизнеспособность, но недостатка в теориях по этому вопросу не ощущаем. Теории жизнеспособности удобно разделить на две группы. Авторы теорий первой группы предполагают, что гибель семян происходит в результате воздействия внешних факторов; авторы теорий второй группы считают, что гибель наступает в результате процессов, происходящих в самих семенах. Оба типа могут до некоторой степени перекрывать друг друга. Так, согласно теории, нашедшей довольно широкую поддержку, потеря жизнеспособности является результатом повреждения ядер, но последнее может происходить вследствие как внутренних, так и внешних событий.
Ионизирующее излучение
Неоднократно высказывалось предположение, что в обычных условиях хранения снижение жизнеспособности может быть вызвано вредоносным действием фоновой ионизирующей радиации. Эта мысль основана на общеизвестном факте, что применение повышенных доз радиации может ускорить потерю жизнеспособности семян и старение других организмов. Кроме того, ионизирующая радиация вызывает появление мутаций и хромосомных аномалий, которые, как мы видели, тесно связаны со снижением жизнеспособности семян. Тем не менее существуют по крайней мере три веских аргумента в пользу того, что фоновая радиация не может играть важную роль при нормальных условиях хранения. Во-первых, имеется много данных, что в смысле снижения жизнеспособности и ослабления роста проростков или индукции рецессивных мутантных фенотипов ионизирующее излучение сильнее повреждает диплоидные виды, чем полиплоидные, в то время как Смит указывал, что в немногих исследованиях, посвященных долговечности полиплоидных и диплоидных семян, нет никаких указаний на благотворное влияние полиплоидии. Отсюда следует, что при нормальных условиях снижение жизнеспособности обусловлено не радиацией. Во-вторых, было показано, что вредное Действие рентгеновских лучей на семена ячменя, определяемое по характеру развития проростков или по появлению хромосомных аберраций, усиливается при понижении влажности семян, в то время как установлено, что в обычных условиях хранения ядерные повреждения и потеря жизнеспособности при уменьшении влажности семян ослабевают. В-третьих, экстраполяция экспериментальных кривых доза — реакция от ионизирующей радиации к фоновому уровню показывает, что последний не мог быть причиной снижения жизнеспособности, наблюдающегося при многих обстоятельствах. Эти аргументы свидетельствуют о том, что, хотя ионизирующее излучение и может вызывать эффект, очень сходный с наблюдаемым в обычных условиях хранения, особенно в отношении индукции ядерных повреждений, фоновая радиация в этих условиях не может быть причиной снижения жизнеспособности. Необходимо, однако, подчеркнуть, что эти аргументы не исключают появления альтернативных теорий, объясняющих причины ядерных повреждений, но при использовании их следует указывать, что повреждения, о которых идет речь, не относятся к повреждениям, вызываемым ионизирующей радиацией.
Плесени хранения
Способность плесеней хранения ускорять гибель семян не вызывает сомнения. Это является одной из причин, почему только этой группе организмов, связанных с семенами, посвящена отдельная глава. Известно, что активность грибов усиливается с повышением температуры, влажности семян и давления кислорода. Следовательно, это объяснение потери жизнеспособности, по-видимому, совместимо с данными о влиянии факторов окружающей среды. Как указывает Кристенсен, в условиях, при которых грибы способны вызвать гибель семян, она может быть результатом либо прямого нападения патогенов, либо влияния выработанных ими токсинов. Несмотря на это, данную теорию по меньшей мере по трем причинам нельзя использовать для универсального объяснения. Во-первых, хотя есть данные, что стерильные семена дольше сохраняют жизнеспособность, чем нестерильные, они ее все-таки со временем теряют. Так, Хуммель, Кевде, Кристенсен и Геддес получили образец пшеницы, свободный от внутреннего мицелия, и подвергли его поверхностному обеззараживанию. Хотя средний период жизнеспособности не указан, его легко можно вычислить. Оказалось, что у необеззараженных семян средний период жизнеспособности был примерно на 18—23% короче, чем у обеззараженных, вероятно, вследствие наличия плесеней хранения. Во-вторых, известно, что плесени хранения при относительной влажности ниже 65% неактивны, между тем снижение жизнеспособности происходит и при более низкой влажности семян. Кроме того, при влажности семян выше и ниже критической для активности грибов наблюдается один и тот же тип зависимости между температурой, влажностью семян и снижением жизнеспособности. В-третьих, хотя парциальное давление кислорода влияет на активность грибов в семенах во время хранения и, следовательно, может косвенно воздействовать на их жизнеспособность, установлено, что кислород продолжает оказывать отрицательное влияние на жизнеспособность гороха при 60°С и влажности семян 12%, т. е. в условиях, когда грибы в семенах почти наверняка неактивны. Таким образом, мы приходим к выводу, что грибы в пределах температуры и относительной влажности, допускающих их активность, могут ускорить снижение жизнеспособности. Но в этих же пределах она продолжает снижаться и в отсутствие микроорганизмов, хотя и не так быстро. В случае, когда условия окружающей среды не допускают активности микроорганизмов, для объяснения потери жизнеспособности, очевидно, следует применять другие теории. На практике в обычных условиях коммерческого хранения семян грибы могут быть очень важным фактором, ускоряющим их порчу. В настоящее время не существует других способов борьбы с плесенями хранения, кроме регулирования условий окружающей среды. Кристенсен и Лопец суммировали результаты применения стандартных фунгицидов и пришли к выводу, что они слабо эффективны. Даже в том случае, если бы у нас появилась возможность подавлять активность грибов иными методами, чем управление условиями окружающей среды, например путем применения высокоэффективных и доступных антибиотиков, все равно долгосрочное хранение семян в типичных условиях окружающей среды оказалось бы невозможным: по-прежнему нужно было бы снижать влажность семян и температуру воздуха. Но и в этих условиях жизнеспособность семян продолжала бы, хотя и медленно, но снижаться. Поэтому при разработке систем долгосрочного хранения мы вынуждены обратиться к теориям о внутренних причинах потери жизнеспособности.
Накопление ингибиторов роста
В литературе не раз высказывалось предположение, что снижение жизнеспособности происходит вследствие накопления различного рода-токсических веществ. Щ. ограничусь здесь разбором нескольких v давно высказанных важнейших предположений, к которым время от времени возвращаются вновь. По мнению Кронера и Кар-тиса и Кларка, хотя оно и не было очень хорошо аргументировано, потеря жизнеспособности может быть обусловлена накоплением продуктов дыхания, а Виттенбах уточнил, что этим продуктом у семян Medicago sativa, Trifolium pratense и Lotus corniculatus является молочная кислота. Однако эта идея противоречит двум фактам. Во-первых, между периодом жизнеспособности и давлением кислорода существует отрицательная зависимость ; во-вторых, при измерении дыхания семян ячменя, райграса многолетнего, красного клевера, яблони и гороха во время хранения было установлено, что их ДК очень малы: в типичных случаях они меньше 0,7 и приближаются к 0,6. По данным Милнера, Кристенсена и Геддеса, метаболизм грибов на пшенице при достаточно высокой влажности семян, поддерживающей развитие плесеней, характеризуется более высоким ДК, равным 0,8. Причина обусловливающая столь низкие значения ДК хранящихся семян неясна, однако это ёще не означает, что накопление продуктов брожения может создавать трудности при хранении семян. Другой группой веществ, относительно которых высказывались предположения, являются жирные кислоты, которые накапливаются по мере снижения жизнеспособности семян. Бартон, составившая сводку материалов по этому вопросу, приходит к выводу, что даже если нередко наблюдается связь с жизнеспособностью, результаты не настолько воспроизводимы, чтобы их можно было использовать в качестве надежного показателя жизнеспособности». Есть данные, что снижение жизнеспособности семя вириса происходит в результате накопления в них индолилуксусной кислоты и других производных индола в концентрациях, превышающих оптимальные. Позднее указывалось, что накопление фенольных соединений, в том числе кумарина и феруловой кислоты, может препятствовать прорастанию семян риса. В настоящее время к этому списку ингибиторов, которые, как считается, предупреждают прорастание семян риса, относят и абсцизовую кислоту.
Хотя скорость поглощения кислорода в обоих вариантах была примерно одинакова, митохондрии из свежих семян этерифи-цировали в два с лишним раза больше неорганического фосфата, чем митохондрии из старых семян; отношение Р/О составляло соот-ветственно 3,0 и 1,4. Это свидетельствует о том, что в митохондриях из старых семян, нарушено сопряжение. Электронные микрофотографии показали, что митохондриальная фракция, выделенная из молодых семян, содержит интактные и вздутые митохондрии, а также пластиды и пузырьки. Аналогичная фракция из старых семян содержала митохондрии с расширенными или вздутыми кристами и коагулированным матриксом, у некоторых из них отсутствовала интактная наружная мембрана. Абу-Шакра и Чинг полагали, что эти морфологические особенности могут и не быть причиной отсутствия эффективности, так как такие же признаки были обнаружены у функционирующих митохондрий, выделенных из Другого растительного материала. Тем не менее уплотнение матрикса является отличительной чертой митохондрий из старых семян. Эти авторы сообщали также, что число митохондрий на проросток в старой ткани было, по-видимому, ниже, чем в новой. Однако без дополнительных исследований трудно установить, являются эти количественные различия функцией возраста семян или скорости роста проростка. Для более достоверного распознавания возможных морфологических различий Абу-Шакра и Чинг предложили проводить исследования in situ. Бержак и Вилье использовали этот метод при изучении семян кукурузы. В серии опытов они изучали также изменения, происходящие во всех других различимых клеточных органеллах. В ходе этих исследований сравнивали семена кукурузы, не подвергавшиеся старению, и семена с влажностью 14%, экспонировавшиеся до 34 дней при 40° С. В этих условиях средний период жизнеспособности составлял около 18 дней, а к 30-му дню она полностью утрачивалась. Изучение давленых препаратов корешков подтвердило, что накопление хромосомных аберраций до некоторой степени напоминало процесс, уже описанный для гороха, бобов и ячменя. Кроме того, кривая, отражающая зависимость между процентом жизнеспособности и процентом аберрантных клеток в выживших семенах, относилась по существу к тому же типу, что и кривая, которую приводят Абдалла и Роберте. У кукурузы относительное число аберрантных конфигураций в анафезе возрастало, асимптотически приближаясь к 9%. Наблюдения за ядром проводились под световым микроскопом, изучение же цитоплазматических органелл было проведено Бержак при помощи электронного микроскопа. Семена, используемые для этих наблюдений, замачивали в воде при 25° С на 12, 24 и 48 ч. Хотя некоторые наблюдения проводились на цельных кончиках корней, детальные исследования были ограничены корневым чехликом, поскольку это давало возможность изучить два различных процесса старения. Первый процесс представляет собой организованное старение клеток корневого чехлика по мере их удаления от калиптрогена. Он происходит во время роста корня и необходим для эффективного функционирования корневого чехлика, которое, как показали наблюдения Бержак, характеризуется повышенной секреторной активностью диктиосом и выделением лизосомных ферментов. Предполагается, что этот тип старения запрограммирован генетически. Но в настоящей книге мы в основном уделяем внимание второму процессу старения, который можно наблюдать в клетках корневого чехлика, т. е. незапрограммированным изменениям, происходящим в хранящихся семенах. При изучении ультраструктуры корневых чехликов семян, которые старели в течение 18—20 дней, были обнаружены разнообразные дегенеративные изменения. По интенсивности происходящих в семенах изменений зародыши были разделены на типы 1, 2 и 3 в порядке усиления серьезности повреждения. Старение коснулось всех органелл, но у зародышей типа 1 повреждения были в значительной мере обратимы: аномалии, появившиеся после набухания семян в течение 12 ч, через 24 или 48 ч нередко исчезали, по-видимому, в результате действия репарационных механизмов. Но у зародышей типов 2 и 3 повреждения в большинстве случаев оказывались необратимыми. Зародыши типа 3 и, вероятно, типа 2 почти несомненно нежизнеспособны. В контроле наблюдались типичные особенности ультраструктуры клеток корневого чехлика. С увеличением возраста семян усиливается тенденция к разделению ядра на лопасти. В то же время хроматин становится более восприимчивым к окрашиванию перманганатом калия. Среди органелл одними из первых претерпевают изменения пластиды, что выражается в деформации внутренней и наружной мембран, сопровождающейся вздутием органелл и уменьшением плотности матрикса. Дегенерация диктиосом начинается с разъединения цистерн, за которым следует их исчезновение. Происходит деформация контуров эндоплазматической сети, первые признаки которой появляются прежде всего в клетках чех-лика и выражаются в увеличении диаметра просветов цистерн; по мере дальнейшего старения контуры ЭС становятся длиннее и тоньше, часто наблюдается значительная гипертрофия; в конце концов у зародышей типа 3 сохраняются только короткие раздутые контуры. В нестаром материале образование полисом становится заметным через 12 ч после начала набухания, но у зародышей старых семян рибосомы на этой стадии набухания по-прежнему в значительной степени разъединены. Считают, что это изменение является скорее результатом замедления метаболизма, чем разрушения иРНК. У зародышей типа 3 на любой стадии видны только моносомы. Как и пластиды, митохондрии относятся к органеллам, которые первыми претерпевают изменения, связанные с возрастом. Их форма становится неправильной, и кроме того, бывает ясно заметна дезорганизация внутренней мембраны, особенно в зоне зрелых клеток; нередко в них возникает своеобразное внутреннее пространство, ограниченное мембраной. У зародышей типа 3 наблюдаются признаки экстремальной дегенерации: митохондрии отличаются слабо выраженной внутренней структурой, и наблюдающаяся на ранних стадиях деформация мембран, по-видимому, исчезает, поскольку органеллы набухают, вероятно, вследствие потери контроля за переносом электронов и одновременного уменьшения плотности матрикса. На промежуточных стадиях старения наблюдается преждевременное развитие лизосом, так что в зонах деления и дифференциации клеток обнаруживаются лизосомы второй фазы. В лизосомных вакуолях часто встречаются остатки митохондрий и пластид. У зародышей типа 3 лизосомы набухают и ограничивающие их мембраны часто кажутся дефектными; при удлинении периода набухания начинается общий распад органелл, и интактных лизосом видно мало. Их исчезновение подтверждается тем фактом, что на этой стадии в протоплазме распространяется кислая фосфатаза. Возможно, что практически все описанные дегенеративные изменения ультраструктуры являются результатом общего повреждения липопротеиновых клеточных мембран. Если ухудшение последних не зашло очень далеко, по-видимому, возможно частичное их восстановление. В противном случае дезорганизация клетки становится необратимой. Это предположение основано на некоторых данных, показывающих, что ЭС до некоторой степени может быть связана с газообменом, поскольку было установлено, что пролиферация ЭС наблюдается в растительных клетках при низких давлениях кислорода и у штаммов дрожжей, лишенных митохондрий. Если повреждение митохондрий является первым звеном в процессе ухудшения семян, можно ожидать, что по мере снижения жизнеспособности будет наблюдаться некоторое ослабление интенсивности дыхания семян, заложенных на проращивание. Тронберри и Смит сообщали о таком снижении у семян кукурузы, но корреляция с потерей жизнеспособности была в этом случае далеко не безупречной. Однако можно согласиться, что если вышеупомянутые компенсирующие механизмы действительно существуют, то, используя простые методы измерения дыхания, можно просто не зафиксировать снижения интенсивности митохондриального дыхания. Но если они отсутствуют, то экспериментально обнаруженные небольшие различия в потреблении кислорода между старыми и новыми семенами ячменя и пшеницы явно противоречат высказанному Бержак предположению о том, что повреждение митохондрий может быть главным фактором, предотвращающим прорастание старых семян. Нарушением целостности мембран по мере старения, видимо, можно объяснить тот факт, что из старых семян в среду, на которой проводится проращивание, выделяется больше метаболитов, чем из свежих. Это явление известно уже в течение некоторого времени, но одно из самых обширных исследований по этому вопросу принадлежит Чингу и Скулкрафту, которые сравнивали семена райграса и красного клевера, хранившиеся в различных условиях в течение десяти лет. Они показали, что существует некоторая корреляция, хотя и не безупречная, между снижением жизнеспособности, электропроводностью экстрактов из семян красного клевера и концентрацией в них Сахаров и аминокислот. Но у райграса корреляция с электропроводностью или концентрацией Сахаров была выражена очень слабо, а с концентрацией аминокислот несколько лучше. В главе 7 указано, что Такаянаги и Мураками разработали простые методы определения жизнеспособности на основе концентрации Сахаров в экстрактах из семян. Однако Абдул-Баки и Андерсон подвергли сомнению обоснованность такого метода испытаний по крайней мере для ячменя, обнаружив, что в быстро стареющих семенах эта корреляция нарушалась. Кроме того, несомненный интерес для настоящей дискуссии представляет их предположение о том, что концентрация глюкозы в экстракте скорее связана с концентрацией этого вещества в семени и поэтому может и не являться показателем целостности мембраны. Бержак и Вилье использовали метод радиоавтографии для изучения характера включения 3Н-тимидина во время четырехчасовой инкубации в конце 48-часового периода набухания. Эти опыты показали, что включение ограничивалось ядрами меристематической зоны чехлика, что указывает на репликацию в них ДНК. Доля меченых ядер составила 6% на чехлик. Но в зародышах семян, подвергавшихся искусственному старению в течение 10—14 дней, доля меченых ядер возрастала примерно до 8,5%. Это увеличение было обусловлено по крайней мере частично включением метки в клетках зон, которые в нормальном состоянии не являются меристематическими. При удлинении периода искусственного старения до 18—20 дней доля клеток чехлика с мечеными ядрами составляла менее 1%. В этих случаях включение носило случайный характер и редко происходило в зоне инициальных клеток или в зоне деления. Бержак и Вилье предложили два объяснения этого положения. Во-первых, это может означать, что мери-стематические клетки более чувствительны к повреждениям, происходящим в процессе старения, и замещаются клетками, обычно находящимися в покое и, как можно предполагать, менее подверженными повреждениям. По-видимому, это явление аналогично положению, когда клетки покоящегося центра меристемы корня начинают делиться после облучения рентгеновскими лучами и замещают поврежденные клетки меристемы. Во-вторых, это может свидетельствовать о повреждении репрессорных механизмов, ингибирующих репликацию ДНК в немеристематических клетках. Из приведенной дискуссии видно, что в настоящее время имеется много данных, которые показывают, что потере жизнеспособности семени предшествует возрастание повреждении практически всех клеточных органелл как в ядре, так и в цитоплазме. При повреждении ядер, за исключением крайне неблагоприятных условий хранения, наблюдается хорошая корреляция между степенью повреждений и потерей жизнеспособности независимо от того, как быстро снижалась жизнеспособность или какие факторы окружающей среды ее в основном вызывали. Эти обобщения справедливы для всех детально изученных видов. Теперь необходимо распространить эти исследования на другие виды и выяснить, какие изменения цитоплазматических органелл происходят при старении семян с различной скоростью и в разных условиях. Подобные работы помогут установить, какие изменения имеют наиболее важное значение. Андерсон, Бекер и Уортингтон опубликовали короткую статью, посвященную изменениям ультраструктуры в осях зародышей пшеницы в процессе хранения. Они сравнивали семена пшеницы, зараженные присущей им микрофлорой и хранившиеся 26 недель при 25°С и относительной влажности 75%, с контрольными семенами, хранившимися при —20°С. Были отмечены различные аномалии, в том числе изменения, которые интерпретировались как слипание липидных телец, отделение плазмалеммы от клеточных стенок и разрыв плазмалеммы. Они предполагали, что эти изменения явились результатом деятельности грибов, но, поскольку ее наличие и отсутствие нельзя отделить от влияния условий хранения, принять с уверенностью их интерпретацию пока невозможно, так как эти изменения могли быть результатом более прямого влияния условий хранения на клеточные органеллы. В дальнейшей работе необходимо разграничить непосредственное воздействие окружающей среды и возможное косвенное влияние микрофлоры на повреждение клеточных органелл. Хотя настоящий обзор посвящен главным образом нормальным семенам, жизнеспособность которых была повышена путем снижения их влажности, необходимо упомянуть, что у семян с довольно высокой оптимальной влажностью с потерей жизнеспособности могут быть связаны совершенно иные цитологические факторы. Например, Генкель и Ши-Хсу связывали снижение жизнеспособности семян кофейного дерева с распадом плазмодесм.
Теории жизнеспособности
Кроме сведений о генетических и цитологических изменениях, происходящих в семенах во время хранения, имеется много данных о разнообразных метаболических различиях между молодыми и старыми семенами. Мы не стремимся дать их полный перечень. Следует отметить, что в большинстве случаев не было обнаружено тесной корреляции между различиями, связанными с возрастом, и снижением жизнеспособности. В настоящей главе речь будет идти лишь о тех изменениях, которые используются в некоторых теориях, предложенных для объяснения потери жизнеспособности. Более подробные сведения по этому вопросу можно найти в других обзорах. Мы до сих пор не знаем, почему семена теряют жизнеспособность, но недостатка в теориях по этому вопросу не ощущаем. Теории жизнеспособности удобно разделить на две группы. Авторы теорий первой группы предполагают, что гибель семян происходит в результате воздействия внешних факторов; авторы теорий второй группы считают, что гибель наступает в результате процессов, происходящих в самих семенах. Оба типа могут до некоторой степени перекрывать друг друга. Так, согласно теории, нашедшей довольно широкую поддержку, потеря жизнеспособности является результатом повреждения ядер, но последнее может происходить вследствие как внутренних, так и внешних событий.
Ионизирующее излучение
Неоднократно высказывалось предположение, что в обычных условиях хранения снижение жизнеспособности может быть вызвано вредоносным действием фоновой ионизирующей радиации. Эта мысль основана на общеизвестном факте, что применение повышенных доз радиации может ускорить потерю жизнеспособности семян и старение других организмов. Кроме того, ионизирующая радиация вызывает появление мутаций и хромосомных аномалий, которые, как мы видели, тесно связаны со снижением жизнеспособности семян. Тем не менее существуют по крайней мере три веских аргумента в пользу того, что фоновая радиация не может играть важную роль при нормальных условиях хранения. Во-первых, имеется много данных, что в смысле снижения жизнеспособности и ослабления роста проростков или индукции рецессивных мутантных фенотипов ионизирующее излучение сильнее повреждает диплоидные виды, чем полиплоидные, в то время как Смит указывал, что в немногих исследованиях, посвященных долговечности полиплоидных и диплоидных семян, нет никаких указаний на благотворное влияние полиплоидии. Отсюда следует, что при нормальных условиях снижение жизнеспособности обусловлено не радиацией. Во-вторых, было показано, что вредное Действие рентгеновских лучей на семена ячменя, определяемое по характеру развития проростков или по появлению хромосомных аберраций, усиливается при понижении влажности семян, в то время как установлено, что в обычных условиях хранения ядерные повреждения и потеря жизнеспособности при уменьшении влажности семян ослабевают. В-третьих, экстраполяция экспериментальных кривых доза — реакция от ионизирующей радиации к фоновому уровню показывает, что последний не мог быть причиной снижения жизнеспособности, наблюдающегося при многих обстоятельствах. Эти аргументы свидетельствуют о том, что, хотя ионизирующее излучение и может вызывать эффект, очень сходный с наблюдаемым в обычных условиях хранения, особенно в отношении индукции ядерных повреждений, фоновая радиация в этих условиях не может быть причиной снижения жизнеспособности. Необходимо, однако, подчеркнуть, что эти аргументы не исключают появления альтернативных теорий, объясняющих причины ядерных повреждений, но при использовании их следует указывать, что повреждения, о которых идет речь, не относятся к повреждениям, вызываемым ионизирующей радиацией.
Плесени хранения
Способность плесеней хранения ускорять гибель семян не вызывает сомнения. Это является одной из причин, почему только этой группе организмов, связанных с семенами, посвящена отдельная глава. Известно, что активность грибов усиливается с повышением температуры, влажности семян и давления кислорода. Следовательно, это объяснение потери жизнеспособности, по-видимому, совместимо с данными о влиянии факторов окружающей среды. Как указывает Кристенсен, в условиях, при которых грибы способны вызвать гибель семян, она может быть результатом либо прямого нападения патогенов, либо влияния выработанных ими токсинов. Несмотря на это, данную теорию по меньшей мере по трем причинам нельзя использовать для универсального объяснения. Во-первых, хотя есть данные, что стерильные семена дольше сохраняют жизнеспособность, чем нестерильные, они ее все-таки со временем теряют. Так, Хуммель, Кевде, Кристенсен и Геддес получили образец пшеницы, свободный от внутреннего мицелия, и подвергли его поверхностному обеззараживанию. Хотя средний период жизнеспособности не указан, его легко можно вычислить. Оказалось, что у необеззараженных семян средний период жизнеспособности был примерно на 18—23% короче, чем у обеззараженных, вероятно, вследствие наличия плесеней хранения. Во-вторых, известно, что плесени хранения при относительной влажности ниже 65% неактивны, между тем снижение жизнеспособности происходит и при более низкой влажности семян. Кроме того, при влажности семян выше и ниже критической для активности грибов наблюдается один и тот же тип зависимости между температурой, влажностью семян и снижением жизнеспособности. В-третьих, хотя парциальное давление кислорода влияет на активность грибов в семенах во время хранения и, следовательно, может косвенно воздействовать на их жизнеспособность, установлено, что кислород продолжает оказывать отрицательное влияние на жизнеспособность гороха при 60°С и влажности семян 12%, т. е. в условиях, когда грибы в семенах почти наверняка неактивны. Таким образом, мы приходим к выводу, что грибы в пределах температуры и относительной влажности, допускающих их активность, могут ускорить снижение жизнеспособности. Но в этих же пределах она продолжает снижаться и в отсутствие микроорганизмов, хотя и не так быстро. В случае, когда условия окружающей среды не допускают активности микроорганизмов, для объяснения потери жизнеспособности, очевидно, следует применять другие теории. На практике в обычных условиях коммерческого хранения семян грибы могут быть очень важным фактором, ускоряющим их порчу. В настоящее время не существует других способов борьбы с плесенями хранения, кроме регулирования условий окружающей среды. Кристенсен и Лопец суммировали результаты применения стандартных фунгицидов и пришли к выводу, что они слабо эффективны. Даже в том случае, если бы у нас появилась возможность подавлять активность грибов иными методами, чем управление условиями окружающей среды, например путем применения высокоэффективных и доступных антибиотиков, все равно долгосрочное хранение семян в типичных условиях окружающей среды оказалось бы невозможным: по-прежнему нужно было бы снижать влажность семян и температуру воздуха. Но и в этих условиях жизнеспособность семян продолжала бы, хотя и медленно, но снижаться. Поэтому при разработке систем долгосрочного хранения мы вынуждены обратиться к теориям о внутренних причинах потери жизнеспособности.
Накопление ингибиторов роста
В литературе не раз высказывалось предположение, что снижение жизнеспособности происходит вследствие накопления различного рода-токсических веществ. Щ. ограничусь здесь разбором нескольких v давно высказанных важнейших предположений, к которым время от времени возвращаются вновь. По мнению Кронера и Кар-тиса и Кларка, хотя оно и не было очень хорошо аргументировано, потеря жизнеспособности может быть обусловлена накоплением продуктов дыхания, а Виттенбах уточнил, что этим продуктом у семян Medicago sativa, Trifolium pratense и Lotus corniculatus является молочная кислота. Однако эта идея противоречит двум фактам. Во-первых, между периодом жизнеспособности и давлением кислорода существует отрицательная зависимость ; во-вторых, при измерении дыхания семян ячменя, райграса многолетнего, красного клевера, яблони и гороха во время хранения было установлено, что их ДК очень малы: в типичных случаях они меньше 0,7 и приближаются к 0,6. По данным Милнера, Кристенсена и Геддеса, метаболизм грибов на пшенице при достаточно высокой влажности семян, поддерживающей развитие плесеней, характеризуется более высоким ДК, равным 0,8. Причина обусловливающая столь низкие значения ДК хранящихся семян неясна, однако это ёще не означает, что накопление продуктов брожения может создавать трудности при хранении семян. Другой группой веществ, относительно которых высказывались предположения, являются жирные кислоты, которые накапливаются по мере снижения жизнеспособности семян. Бартон, составившая сводку материалов по этому вопросу, приходит к выводу, что даже если нередко наблюдается связь с жизнеспособностью, результаты не настолько воспроизводимы, чтобы их можно было использовать в качестве надежного показателя жизнеспособности». Есть данные, что снижение жизнеспособности семя вириса происходит в результате накопления в них индолилуксусной кислоты и других производных индола в концентрациях, превышающих оптимальные. Позднее указывалось, что накопление фенольных соединений, в том числе кумарина и феруловой кислоты, может препятствовать прорастанию семян риса. В настоящее время к этому списку ингибиторов, которые, как считается, предупреждают прорастание семян риса, относят и абсцизовую кислоту.
