Хотя жизнеспособность сама по себе здесь значения не имеет, существенное внимание было уделено связи между ее снижением и происходящими в семенах химическими изменениями, поскольку было установлено, что жизнеспособность является хорошим показателем этих изменений. Зелени составил обзор типичных химических изменений, происходящих в семенах зерновых культур по-мере потери ими жизнеспособности. К ним относится снижение содержания белка и нередуцирующих Сахаров и повышение содержания редуцирующих Сахаров и свободных жирных кислот. В большинстве работ эти изменения были связаны с активностью микроорганизмов: так, было показано, что условия, способствующие повышению численности плесневых грибов на семенах или инокуляция плесневыми грибами ) могут привести к повышению содержания жирных кислот у пшеницы. У кукурузы при увеличении: влажности семян повышается содержание жирных кислот и снижается количество нередуцирующих Сахаров. Однако в опытах: с семенами ячменя и пшеницы, проведенных при влажности семян 12% и температуре от 30 до 40°С, также была обнаружена связь между потерей жизнеспособности и снижением содержания белка и общих Сахаров, и увеличением свободных жирных кислот и редуцирующих Сахаров. Так: как в опытах использовали семена с низкой влажностью, маловероятно, чтобы активность микроорганизмов играла в этих изменениях какую-то роль. Таким образом, хотя микроорганизмы и могут ускорить эти изменения, их участие, по-видимому не является обязательным. Несмотря на то что катаболические изменения ведут, к утрате-некоторой части запасов основных питательных веществ в семенах,, вряд ли эти потери являются причиной снижения жизнеспособности. По данным Бартон, семена, потерявшие жизнеспособность, по-прежнему содержат большие количества важнейших питательных веществ, а по наблюдениям Джеймса, некоторые семена с большими запасами питательных веществ портятся быстрее, чем семена с небольшими запасами. Кроме тото, оказалось, что вредное влияние кислорода проявлялось и при такой комбинации температуры и влажности семян, когда дыхание, вероятно, было подавлено, хотя следовало ожидать, что основные факторы, вызывающие снижение жизнеспособности, должны усиливать дыхание. Следовательно, влияние кислорода на снижение жизнеспособности осуществляется, по-видимому, не через дыхание, а посредством какого-то иного процесса. Что касается дыхательных субстратов неуглеводной природы, например липидов и белков, то по данным Оуэн, снижение жизнеспособности нельзя объяснить исчерпанием этих резервов. И, наконец, следует рассмотреть вопрос о возможности истощения запасов веществ, требующихся только в небольших количествах. Теории этого типа нельзя опровергнуть, если вещество точно не указано. В настоящее время по этому поводу можно оказать следующее. Хотя и обнаружено, что содержание некоторых веществ, например тиамина и аскорбиновой кислоты, с возрастом уменьшается ), это пока не удалось связать с потерей жизнеспособности. Денатурация белков Эварт указывал, что «долговечность зависит не только от питательных веществ или семенных оболочек, но и от того, как долго инертные молекулы протеидов, на которые при высыхании распадается живая протоплазма, при попадании в условия достаточного увлажнения и снабжения кислородом сохраняют способность создавать молекулярные группировки, допускающие их рекомбинацию с образованием активных протоплазматических молекул. Необходимо добавить, что в начале текущего века Эварту было трудно экспериментально подкрепить свое утверждение. Тем не менее главная мысль, что белки могут терять свою целостность, требует тщательного обсуждения, поскольку в настоящее время появилась возможность проверить это экспериментально. Гровс вывел уравнение, связывающее период жизнеспособности семян пшеницы с высокими температурами. Оно было основано на уравнении Лепешкина, которое, в свою очередь, вытекало из работы Бутлия по коагуляции кровяной сыворотки и было предназначено для изучения влияния температуры на гибель живого растительного вещества. Роббинс и Петч на основании опытов, проведенных при высоких температурах, предположили, что кривая, связывающая снижение жизнеспособности семян пшеницы и кукурузы с их влажностью, имеет в общих чертах такую же форму, что и кривая зависимости между коагуляцией белков и влажностью семян. Таким образом, имеется указание, что данные о влиянии температуры и влажности семян на жизнеспособность последних не противоречат идее о наличии связи между снижением жизнеспособности и денатурацией белков. Крокер, хотя и принимал участие в развитии этой; идеи, позднее больше склонялся к теории ядерной дегенерации в, а в конце концов пришел к следующему заключению : «Недостаток этой теории в том, что она слишком обща. В зародыше имеется множество различных типов белков, а эта работа не дает никакого представления ни о том, какие белки с течением времени коагулируют, ни о возможности дегенерации какого-либо клеточного механизма». Это замечание помогает понять, почему сторонники теорий, основанных на денатурации белков, склонны концентрировать внимание в отдельных ферментах. В настоящее время большинство работ по снижению активности ферментов трудно отделить от теорий, базирующихся на нестабильности ДНК или долгоживущей иРНК, поскольку мы до сих пор не знаем, какие ферменты уже присутствуют в покоящихся семенах и какие должны синтезироваться de novo при набухании. В теориях, касающихся жизнеспособности, наибольшее внимание было уделено дыхательным ферментам, между жизнеспособностью и общей активностью де-гидрогеназ существует достаточно хорошая корреляция, на что указывают результаты испытаний с помощью тетразольного метода. Однако следует заметить, что, хотя это, вероятно, пока лучший химический метод испытания жизнеспособости, корреляция далеко не безупречна, хорошо известно об отсутствии корреляции в определенных условиях, например у семян ячменя. Изучали также и активность многих специфических дегидрогеназ и оксвдаз таких, как каталаза, фенолаза, дегидрогеназа яблочной кислоты, алкогольде-гидрогеназа и цитохромоксидаза, но корреляция с жизнеспособностью в этих случаях была, пожалуй, хуже, чем в случае измерения общей дегидрогеназной активности. Денатурация липопротеиновых клеточных мембран На основании результатов своих опытов, о которых здесь говорилось, Бержак высказала предположение, что снижение жизнеспособности может быть результатом утраты целостности клеточных мембран. Достоинство этой теории в том, что на ее основе можно объяснить быстрое снижение жизнеспособности при повышении давления кислорода, так как, согласно этой теории, ненасыщенные жирные кислоты, являющиеся компонентами липидов мембраны, в аэробных условиях могут окисляться с образованием перекисных соединений. Сначала молекула липида теряет водород, в результате чего сама становится свободным радикалом, который, в свою очередь, может вступать в реакцию с кислородом, образуя перекись и изменяя, таким образом, природу мембраны. На основе этой теории можно также объяснить ускоренную потерю жизнеспособности под влиянием ионизирующего излучения, о чем упоминалось выше. Бержак предполагает, что наибольшее значение может иметь повреждение митохондрий, так как оно повлекло бы за собой снижение эффективности дыхания, что, в свою очередь, приводит к потере жизнеспособности. Чтобы придать этой теории большую достоверность, необходимо исследовать повреждения ультраструктуры в широких пределах условий хранения и распространить эти наблюдения на другие виды. Денатурация нуклеиновых кислот Эта теория выделена из групп теорий, связанных с накоплением мутагенов, поскольку нет необходимости делать заключение о накоплении химических мутагенов, чтобы постулировать возможность потери жизнеспособности в результате повреждений ядра. Гриер и Даменхоф в опытах in vitro по влиянию температуры на сухую ДНК и ДНК в растворах показали, что в обоих случаях с повышением температуры усиливается депуринизация ДНК, причем в растворе этот процесс идет более интенсивно. Таким образом, можно ожидать, что повышение температуры и влажности семян активирует депуринизацию ДНК. Они пришли к выводу, что «депуринизация при высокой температуре может быть причиной спонтанных мутаций и происходит в покоящихся клетках, поскольку этот процесс наблюдается и в отсутствие синтеза ДНК». Из всех упомянутых до сих пор теорий именно те, которые основаны на повреждениях ядер, получили наибольшее признание в опубликованных ранее обзорах по жизнеспособности семян. Результаты опытов, описанных в начале этой главы, показали, что, за исключением случаев, когда семена хранили в особенно неблагоприятных условиях, между снижением жизнеспособности и ловреждениями ядер существует очень хорошая корреляция. Однако на основе этой теории трудно ответить, например, на такой вопрос. Какие повреждения ядра приводят к потере семенами способности к прорастанию? Так, хотя разрыв хромосом является надежным показателем снижения жизнеспособности, это видимое повреждение само по себе, вероятно, не может быть причиной ухудшения семян, так как клетки с большим количеством повреждений этого типа сохраняют способность по крайней мере к одному клеточному делению. Если же клетка сохраняет достаточную целостность, чтобы делиться, она, по-видимому, способна и к необходимому для прорастания растяжению. Далее можно предположить, что, хотя разрыв хромосом сам по себе не имеет важного значения, существенную роль могут играть сопровождающие его генные мутации, а поскольку большинство мутаций вредно, то потеря жизнеспособности является результатом их накопления. Как известно, большинство мутаций еще и рецессивно, поэтому можно ожидать, что репликация хромосом, т. е. повышение уровня плоидии, может способствовать сохранению жизнеспособности. Однако при обсуждении теорий, основанных на фоновой радиации, уже указывалось, что в естественных условиях хранения высокий уровень плоидии, по-видимому, не дает преимуществ в отличие от случаев, когда семена подвергаются действию ионизирующего излучения. Таким образом, хотя на основе простой мутационной гипотезы можно было бы объяснить старение,, вызванное ионизирующим излучением, применить ее к старению в более нормальных условиях нельзя. Действительно, нет полной уверенности, что для прорастания необходима целостность хромосомной ДНК. Хотя концепция долгоживущей РНК в семенах еще не может быть принята безоговорочно, существует теория, получающая все большее признание, согласно которой ранние стадии прорастания могут протекать в отсутствие процесса транскрипции. Следовательно, возможно, что на ранних стадиях прорастания ДНК не требуется. Если нужно постулировать теории, основанные на стабильности"' нуклеиновых кислот, то важнейшие из них можно сформулировать следующим образом. 1) Старение вызывают доминантные летальные мутации. По имеющимся данным, индукцией именно таких мутаций можно объяснить потерю жизнеспособности яиц осы под действием ионизирующего излучения. 2) Старение является результатом дерепрессии генов, которые должны оставаться подавленными, что приводит к бессмысленной комбинации активных генов; эта идея, упоминавшаяся и раньше, основана на теории: старения млекопитающих, в которой постулируется, что мутация может привести не к полной инактивации цистрона, а к отсутствию комплементарности между цистроном и репрессором, в результате чего происходит дерепрессия гена. 3) Старение является результатом денатурации других форм ДНК. В этом случае можно предположить, что наблюдаемое ядерное повреждение является отражением общей деградации ДНК, но к потере жизнеспособности, возможно, имеет отношение только повреждение цитоплазматической ДНК. 4) Старение представляет собой результат денатурации долгоживущей иРНК, которая играет в клетке важную роль на ранних стадиях прорастания. Все эти теории могли дать представление о мутациях, происхождение которых случайно, но средняя частота зависит от температуры, влажности семян и наличия кислорода. Для этого процесса но требуется образования стабильных мутагенов, хотя в нем вполне могут участвовать свободные радикалы, которые можно рассматривать как недолговечные мутагены. Такие теории, основанные на представлении о случайно происходящих событиях, можно назвать «стохастическими». Теории, основанные на потере клеток или на мутациях, представляющих собой случайные процессы, называются стохастическими теориями ; иначе говоря, они зависят от случайных попаданий, как если бы из ряда погибших один умер не в результате поражения картечью, а от обстрела микропулями, которые от случая к случаю поражали по клетке, пока число пораженных клеток не достигло такого уровня, чтобы это привело к смерти. Получаемые на практике кривые выживаемости, характеризующие нормальное распределение гибели во времени, хорошо согласуются с теориями накопления или истощения. Легко представить, что при определенном сочетании условий окружающей среды по истечении некоторого периода времени могут накапливаться какие-то токсические вещества или истощаться необходимые метаболиты, но конечные точки этого процесса для каждого отдельного семени, беспорядочно варьируя, группируются вокруг среднего периода. Однако было показано, что ко многим одноклеточным покоящимся тельцам подобные теории неприменимы: их кривые выживаемости скорее совместимы с представлением о том, что каждая особь подвергается постоянной опасности стать жертвой несчастного случая. Прежде чем разбирать вопрос о совместимости кривых выживаемости семян со стохастической теорией старения, следует обсудить свойства кривых выживаемости типичных одноклеточных организмов. Рассмотрим кривые выживаемости спор и неделящихся вегетативных клеток бактерий. В типичных случаях они имеют линейный характер, когда логарифм числа выживающих организмов наносят на график в зависимости от времени; обычно это выражают формулой: N = Noа, где N — число организмов, выживших за время из числа первоначальной популяции No, a — константа. При альтернативных способах выражения той же зависимости это означает, что скорость гибели с течением времени остается постоянной или что сколько бы времени бактериальная клетка ни выживала, ее шанс погибнуть в течение следующего интервала времени остается тем же самым. Форма кривой выживаемости популяции будет такой же, как для партии стаканов в кафетерии. Стаканы не стареют, они просто каждый день подвергаются опасности быть разбитыми. Эта аналогия приложима к бактериям, и при данном типе кривой выживаемости применить гипотезы об аккумуляции или истощении метаболитов к объяснению потери жизнеспособности бактериальных популяций было бы трудно. Фактически можно сказать, что бактерии умирают, но не стареют, поскольку, согласно одному из существующих определений старения, вероятность гибели с возрастом увеличивается. Затем рассмотрим обычное изменение, которое может произойти с типичной кривой выживаемости бактерий. Так, кривые выживаемости некоторых стафилококков имеют S-образную, но очень асимметричную форму, с острым плечом и длинным хвостом. Следовательно, хотя такая кривая еще очень не похожа на типичную кривую выживаемости семян, она гораздо ближе к ней, чем типичная кривая выживаемости бактерий. В случае бактерий необходимо, чтобы в таком комочке выжила только одна клетка, и тогда он сможет образовать новую колонию и будет отнесен к категории живых. Экспериментально можно показать, что кривые выживаемости стафилококков очень хорошо соответствуют этому выражению, если значение подставляется в соответствии со степенью образования комочков. Такое поведение сгруппировавшихся в комочки бактериальных клеток наводит на мысль о возможной модели поведения семян. Можно ли рассматривать семена как группу клеток, в которой шанс каждой отдельной клетки стать нефункциональной остается неизменным, независимо от того, как долго она выживает? Очевидно, комочек клеток в семени должен быть крупным, хотя маловероятно, что все клетки зародыша остаются живыми вплоть до появления способности к прорастанию. Но можно предположить, что существует группа ключевых клеток, большинство из которых должно остаться в функциональном состоянии, если семя, сохраняет способность к прорастанию. Если число функциональных ключевых клеток снизится за пределы некоторого критического уровня, то семя не прорастает и будет отнесено к мертвым. Вопрос заключается в том, можно ли на основании разработанной таким образом модели воспроизвести отрицательное нормальное распределение, встречающееся на практике. Первоначальные грубые математические аналогии показали, что это возможно, но разработка аналитического решения оказалась непростым делом, хотя в конце концов это было осуществлено Р. Дж. Оуэном . Однако пользоваться аналитическим методом решения нелегко, и при дальнейшем исследовании этой гипотезы мы применили метод моделирования для построения теоретических кривых выживаемости. При создании модели предполагалось, что семя содержит некоторое количество ключевых клеток; летальные случаи происходят с этими клетками случайно, и для каждой из них существует .одинаковая вероятность стать жертвой летального случая в течение каждой единицы времени; после гибели критического числа клеток семя считается мертвым. Чтобы имитировать продолжительность жизни отдельного семени, были произвольно установлены и введены в программу следующие условия: число ключевых клеток, вероятность несчастного случая для клетки в единицу времени и критическое число погибших клеток, приводящее к потере жизнеспособности. Затем программа была запущена, и продолжительность жизни каждого смоделированного семени записывалась в произвольных единицах времени. Для каждой комбинации условий программу повторяли 100 раз. На основе периодов выживаемости отдельных смоделированных семян можно было построить кривую выживаемости популяции, состоящей из 100 семян, в указанных условиях. На основании проверки смоделированных кривых выживаемости, построенных для различных комбинаций условий, оказалось возможным определить пределы, в которых гипотеза соответствует экспериментальным наблюдениям над реально существующими семенами. Смоделированные кривые выживаемости должны отвечать следующим требованиям : 1) кривые должны описывать отрицательные нормальные распределения; 2) независимо от скорости старения коэффициент вариации распределения гибели семян во времени для данного вида должен оставаться постоянным, т. е. должно быть применимо уравнение ; коэффициент вариации должен составлять от 20 до 40% ; другими словами, значение К в уравнении должно составлять от 0,2 до 0,4. Вообще говоря, установлено, что эти условия выполняются, когда число ключевых клеток составляет от 100 до 1000, а критическое число погибших клеток — от 10 до 20. Можно видеть, что это семейство кривых отражает нормальное распределение ; когда вероятность гибели клеток меняется, коэффициент вариации остается прежним, о чем говорит одинаковый отрезок ординаты, и вычисление показывает, что коэффициент вариации равен 21%. Таким образом, данные отвечают всем установленным условиям. В дополнение к этим смоделированным кривым выживаемости на рисунке 55 для сравнения приведено несколько других кривых, не отвечающих требуемым условиям; однако эта модель показывает, что биологические условия, которые должны отвечать такой стохастической теории, не являются необоснованными. Она показывает также, что нет необходимости постулировать, что отдельные клетки зародыша ведут себя, как типичные стареющие; они могут вести себя, как бактериальные клетки; тогда старение становится свойством нестареющих клеток, объединенных в группы. Эта модель представлена здесь по двум причинам. Во-первых, нужно подчеркнуть, что следует без предубеждения относиться ко всем типам гипотез, требующих дополнительных исследований; по-видимому, в настоящее время все теории, как основанные на аккумуляции или истощении метаболитов, так и стохастические, в одинаковой мере обоснованы. Вторая причина заключается в том, что модель показывает возможную связь между поведением семян и покоящихся клеток одноклеточных организмов, выполняющих сходную функцию; поэтому есть надежда, что, исследуя более просто организованные структуры, мы сможем лучше познать жизнеспособность семян.