Изменение гистонов
Как известно (Кольман, Рем, 2000; Cooper, 2000; Карпов, 2005), компактизация ДНК осуществляется с помощью гистонового октамера, состоящего из гистонов Н2А, Н2В (в виде двух димеров) и НЗ, Н4 (в виде тетрамера). Тетрамер можно представить в виде цилиндра, который с торцовой стороны прикрыт одним из димеров Н2А/Н2В. Вокруг гистонового октамера (длиной 10-11 нм и диаметром 8-10 нм) наматывается двойная цепочка ДНК из 146 пар оснований (п.о.), образующая примерно 1,8 витка. Гистоновый октамер с закрученной вокруг него ДНК называют нуклеосо-мой. Хромосома состоит из большого числа нуклеосом, из которых две соседние связаны линейным (длиной 10-50 п.о., реже больше) участком двойной цепочки ДНК, называемым линкерным. Таким образом 75-90% геномной ДНК связано в нуклеосомах. Линкерная ДНК может быть ассоциирована с негистоновыми белками. Поскольку ДНК не делает два полных оборота, то точка входа линкерного отрезка в нуклеосому и точка выхода из нее следующего отрезка, будут находиться на некотором удалении друг от друга. Эти две точки (вхождения и выхода в нуклеосому линкерных ДНК) связаны между собой опосредованно, через пятый гистоновый белок HI (Kasinsky et al., 2001), получивший название линкерного. Весь комплекс гистонов и ассоциированная с ними ДНК длиной 165 п.о. (с каждой стороны нук-леосомы добавляется по 10 п.о. за счет связи с HI) называют хромато-сомой. Благодаря тому, что между нуклеосомами имеется свободный участок линкерной ДНК, те могут быть плотно упакованы в суперспираль размером 30 нм, формируемой шестью соседними нуклеосомами (Allis et al., 2007). Для объяснения их структурной упаковки предложены две модели — соленоидная и зиг-заг модель. Последние данные свидетельствуют в пользу второй модели (Schlach et al., 2005). 30-нанометровые фибриллы в свою очередь часто упорядочены в спираль следующего уровня (хромонему) шириной 100 нм (Horn, Peterson, 2002). В целом пока не вполне ясно, сколько уровней спирализации характеризуют компактизованную ДНК. Выявлены особые хроматиновые домены, организованные в петли, которые прикрепляются с помощью ламинов к ядерной оболочке. В результате внутреннее пространство ядра распадается на так называемые хромосомные территории, имеющие функциональное значение (Crerner et al., 2006; Heard, Bickmore, 2007; Lanctot et al., 2007; Meaburn, Misteli, 2007). Каждый гистон имеет свободные С- и N-терминальные фрагменты (хвосты). N-хвосты гистонов НЗ и Н4 нависают над спиралью ДНК. Длина хвостов составляет от 15 аминокислот в Н2А до 38 в НЗ (о последовательностях аминокислот в хвостах см. Lund, Lohuizen, 2004). Гистоновые хвосты являются регуляторами активности соответствующих участков ДНК и их регуляторные возможности определяются посттрансляционными изменениями аминокислотных остатков (Strahl, Allis, 2000; Jenuwein, Allis, 2001; Cosgrove, Wolberger, 2005; Mersfelder, Parthun, 2006; Колотова и др., 2007). Ковалентная модификация гистоновых хвостов осуществляется (рис. 8.2) через ацетилирование ли-зиновых остатков, метилирование лизиновых и аргининовых остатков, убиквитинирование лизиновых остатков, фосфорилирование се-риновых и треониновых остатков, а также ADP-рибозилирование остатков глутаминовой кислоты (Peterson, Laniel, 2004). В последние годы (Shiio, Eisenman, 2003; см. также Hilgarth et al., 2004) был открыт еще один механизм модификации гистонов, так называемая СУМО-модификация (или сумоилирование — sumoylation от SUMO: small ubiquitin-related modifier). Реже имеют место процессы гликозилирования, биотинилирования и карбонилирования. Другой параметр модификации гистоновых хвостов связан с числом меток на аминокислотный остаток. Например, е-аминогруппа ли-зинового остатка может соединяться с одной, двумя или тремя метальными группами, гуанидине-аминогруппа аргининового остатка — с одной или двумя метальными группами, которые могут располагаться симметрично или асимметрично (Margueron et al., 2005). Число меток коррелирует с уровнем экспрессии генов. Для конститутивных (постоянных) гетерохроматиновых участков характерно наличие трех метальных групп на лизиновом остатке К9 гистона НЗ (НЗК9, или H3Lys9) и К20 гистона Н4 (Arney, Fisher, 2004; Grewal, Rice, 2004). В пограничных участках между эухроматином и гетерохроматином известен так называемый эффект положения варьирующего типа (PEV — Position-effect variegation) у дрозофилы (см. Жимулев, 2003; Жимулев, Беляева, 2003), выражающийся в глушении эухроматиновых генов, оказавшихся в результате хромосомных перестроек или транспозиции по соседству с гетерохроматиновыми последовательностями. Степень глушения варьирует между клонами клеток. Эффект обусловлен действием ряда генов, выступающих в качестве активатора (гены E(var)s) или супрессора (гены Su(var)s) эффекта (Жимулев, 2003; Cheung, Lau, 2005). Ген Su(var)3-9 у дрозофилы (С1г4 у Schizosaccharomyces pombe) кодирует гистон-метилтрансферазу для метилирования НЗК9. Другой ген Su(var)2-5 кодирует гетерохроматиновый белок НР1, который блокирует метилированные НЗК9, инициируя образование гетерохроматина, а в последующем поддерживая структуру последнего. У S. pombe при формировании гетерохроматина метилтрансфераза С1г4, метилирующая НЗК9, поставляется RITS-комплексом. Мы еще вернемся к этому при рассмотрении малых РНК. Гены, блокированные НР1, будут неактивными. Напротив, реструктурирующий нуклеосому фактор, геликаза CHD1 (Chromodomain helicase DNA binding protein 1), соединяясь с триметилированным Lys4 в хвосте НЗ (НЗК4теЗ), вызывает локальное разуплотнение хроматина. Это состояние в сочетании с общим ацетилированием отличает активно работающие гены. Наконец, в последнее время показана важная роль посттрансляционной модификации коровых (глобулярных) доменов гистонов (Mersfelder, Parthun, 2006). Так для эухроматина наряду с метилированием Lys4 в хвосте НЗ характерно метилирование лизинового остатка Lys79 в глобулярной области НЗ. К настоящему времени описано более 30 подобного рода посттрансляционных изменений. Хроматиновые метки образуют мозаичную картину, специфическим образом меняя свойства гистонов (заряд, гидрофобность, плотность упаковки и др.). При этом меняется сродство нуклеосомы с разными транскрипционными факторами и возможность доступа последних к регуляторным последовательностям ДНК. Некоторые изменения гистоновых хвостов, связанные, прежде всего, с фосфорилирова-нием аминокислотных остатков, играют роль молекулярных переключателей, индуцирующих другие модификации. Структура эпигенетических меток, а также характер их взаимодействия, выражающийся в первую очередь в том, что модификация одного гистонового остатка определяет последующую модификацию в том же самом положении, а нередко и в других, составляет гистоновый код (о правилах гистонового кода см. Margueron et al, 2005). Гистоновый код описывает усойчивые модифицированные состояния гистоновых хвостов, которые являются мишенями хроматин-изменяющих комплексов, действующих для обеспечения определенного профиля экспрессии генов. Гистоновый код определяет транскрипционный спектр, а также влияет на скорость и продолжительность транскрипции, вплоть до ее полной остановки (Jenuwein, Allis, 2001; Pal, Hurst, 2004). Так, фос-форилированию SerlO в НЗ в эухроматиновых участках сопутствует активность ранних генов. Транскрипционная активация также связана с метилированием остатков Arg2, Argl7, Arg26 в НЗ и Arg4 в Н4 (Lachner et al., 2003). Факультативные гетерохроматиновые участки отличаются диметилированием Lys9 гистона НЗ. Определенный спектр хроматиновых меток, до конца не выявленный, делает возможным преобразование нуклеосом с помощью так называемых АТФ-зависимых ремоделирующих комплексов (Allis et al., 2007). Важная роль в АТФ-зависимом преобразовании хроматина принадлежит белковому комплексу SWI/SNF. Этот комплекс изменяет уровень сцепления ДНК с гистонами, делая возможным скольжение нуклеосом относительно друг друга и образование петель нитями ДНК. При этом соответствующий участок ДНК освобождается от излишних контактов для выполнения транскрипционной функции. SWI/ SNF-комплекс при определенных условиях может действовать и как репрессор. Наконец, комплекс способен перемещать нуклеосомы, благодаря чему может стираться метилированность ДНК. Другие АТФ-зависимые нековалентные механизмы участвуют в замещении одних гистонов на другие их варианты. АТФ-зависимые ремоделирующие комплексы наряду с прямой транскрипционной активацией участвуют во многих других внутриядерных процессах, в том числе имеющих непосредственное отношение к механизмам памяти — процессам (де)ацетилирования и поддержания метилированного состояния ДНК (Fyodorov, Kadonaga, 2001; Simone, 2006).
Структура вновь формируемого хроматина, в том числе модификация гистоновых хвостов и архитектура метилирования ДНК часто определяется строением хроматина материнской клетки. В этих случаях имеет место сохранение структуры хроматиновых меток при клеточных делениях. Если структура хроматиновых меток исходно индуцируется средой, то можно говорить о клеточной памяти. Классическим примером клеточной памяти, основанной на хроматиновых метках, являются процессы яровизации (вернализации) — наличии в жизненном цикле некоторых растений холодовой стадии воздействия на растения низких положительных температур (1-7°С) в течение 1-3 месяцев (см. Медведев, 2004). Только прошедшие эту стадию растения зацветают. Во время весеннего возобновления роста память о том, что растение прошло яровизацию, передается новым клеткам при клеточных делениях, в том числе и тем, которые непосредственно будут формировать генеративные органы. Возбуждение (влияние холода) и ответная реакция (цветение) отделены временным промежутком, который может быть очень большим, например до 300 дней у белены Hyocyamus niger (Goodrich, Tweedie, 2002). Молекулярные механизмы яровизации (данные по Arabidopsis) связаны с изменением хроматиновой структуры гена Flowering locus С (FLC), который в активном состоянии является репрессором цветения. Это изменение начинается с деацетилирования двух лизиновых остатков (К9 и К14) гистона НЗ в результате индуцированной холодом экспрессии гена Vin3 (Vernalization insensitives 3). Как правило, ацетилирование уменьшает взаимодействие гистонов с ДНК, облегчая транскрипцию, а деацетилирование имеет обратный эффект (но у дрожжей деацети-лирование активирует транскрипцию). В итоге создаются условия для метилтрансферазной активности белков, кодируемых генами Vrnl/Vrn2 (Vernalization). Эти белки метилируют лизиновые остатки в 9-м и 27-м положениях гистона НЗ в хроматине FLC (Sung, Amasino, 2004; 2005). Весной с наступлением тепла Vin3 прекращает экспрессию. Метилированные состояния НЗ в хроматине гена FLC устойчиво передаются при клеточных делениях и без участия Vin3. В отсутствие экспрессии FLC начинает работать комплекс генов под общим названием флоральных интеграторов. Таковы гены SOC1 (SUPPRESSOR of OVEREXPRESSION of СONSTANS1или COl) и FT (FLOWERING LOCUS T), регуляция которых определяется также длиной светового дня. Эти гены определяют переход генеративной меристемы в цветковую (Медведев, 2004), активируя гены флоральной идентичности меристемы LEAFY и APETALA1(AP1), которые собственно и запускают процесс цветения. Молекулярная схема яровизации пшеницы известна хуже; вместо FLC репрессором цветения является Vrn2, но каким образом метилируются связанные с ним гистоны неизвестно. Ген Vrnl запускает процесс цветения и функционально соответствует флоральным интеграторам арабидопсиса. Мы упомянули пшеницу лишь по той причине, что ее гены Vrnl/Vrn2 не гомологичны одноименным генам из арабидопсиса (Amasino, 2004; Sung, Amasino, 2005). В рассмотренном примере основу памяти составляет отложенная реакция организма на действие среды. Эта задержка, во-первых, должна выражаться в каких-то молекулярных механизмах. Во-вторых, задержанный ответ организма должен индуцироваться каким-то сре-довым стимулом. В итоге мы имеем следующую схему отложенной во времени реакции организма: действие на организм факторов среды (Fj) —> память об этом действии —> действие среды (F2) —> ответная реакция, основанная на памяти о действии F,. Рассмотрим подробнее механизмы формирования клеточной памяти данного типа.
Polycomb-репрессирующий комплекс
Гены Vml/Vm2 из арабидопсиса кодируют белки, которые имеют гомологи с той же репрессирующей функцией у животных. Все эти и гомологичные белки в других группах объединяются под общим названием белков Polycomb-репрессирующего комплекса (Polycomb repressive complex — PRC, или PC), или Polycomb-группы (PcG). Эти гены кодируют мультипротеи-новые комплексы, ключевую роль в которых играют различные гис-тон-метилтрансферазы (ГМТазы — HMTases). Метилтрансферазы изменяют хроматиновое состояние генов, метилируя лизиновые остатки хвостов гистонов НЗ или Н4, причем метилированные состояния способны передаваться при делении дочерним клеткам. Механизм формирования памяти в этом случае связан с обратимым изменением структуры, имеющим функциональное значение, которое сохраняется некоторое время и может передаваться от клетки к клетке.
У животных эти белки вместе с белками Trithorax-комплекса (Тгх) в процессе развития эмбриона взаимодействуют с гистонами и вызывают наследуемые изменения последних, прекращая или, наоборот, вызывая экспрессию соответствующих генов. У дрозофилы Polycomb-белки участвуют в образовании двух мультипротеиновых комплексов, PRC1 и PRC2 (Orlando, 2003; Levine et al., 2004). Второй комплекс включает метилтрансферазу E(z) [Enhancer of zeste], которая метилирует НЗК9 или (что случается чаще) НЗК27 (Kirmizis et al., 2004). Два других белка ESC [Extra sex combs] и Su(z)12 [Suppressor(12) of zeste] являются модуляторами E(z). В метилировании участвует особый домен SET, названный по первым буквам белков Su(var)3-9, E(z) и Тгх, в которых этот домен был найден. Метилированные гистоны являются мишенью PRC1-комплекса, который связываясь с метилированным НЗК27 блокирует работу соответствующего гена. PRCI-KOM-плекс включает ингибиторы транскрипции Ph [Polyhomeotic] и PSC [Posterior sex combs], белок Рс [Polycomb], который осуществляет непосредственную связь комплекса с метилированными остатками через особый хромодомен (Levine et al, 2004). Из других элементов PRC1-комплекса упомянем белок PHO (Pleiohomeotic), опознающий особую регуляторную последовательность ДНК в промоторе регулируемого гена и известную как PRE (Polycomb response element) или СММ (Cell memory module). У млекопитающих PRE-аналог не был найден. Trx-комплекс является активационным и выступает в качестве своего рода антагониста PRC, выводя гены из состояния заглушенности (Poux et al., 2002). Ключевые белки этого комплекса — Ashl, Su(var)3-9 и Тгх, также являются гистон-метилтрансферазами, но они метилируют лизиновые остатки в других положениях. Например, Ashl и Тгх ГМТазы метилируют НЗК4 и Н4К20; ди- и триметилирование НЗК9 контролируется Su(var)3-9 ГМТазой (Ebert et al., 2004). Итогом является активность соответствующих генов. Отмечена важная роль белков Polycomb-комплекса в репрессии гомеозисных генов, соответственно Нох-генов у животных (по насекомым см. Шаталкин, 2003) и MADS-box генов у растений (Koller, Grossniklaus, 2002; Шаталкин, 2007). У насекомых PRC в норме репрессирует задние Нох-гены в передних отделах тела. Мутации в этих генах ведут к постериоризации сегментов и к формированию в голове и груди признаков, характерных для брюшных сегментов. При умеренных нарушениях происходит частичная трансформация в противоположном направлении. Например, вторая и третья пары ног у Drosophila становятся похожими на первую и у самцов несут половые гребешки (sex combs) на члениках лапок (отсюда название Polycomb). MADS-box гены являются функциональными аналогами Нох-генов. Но они есть и у животных, что отражено в их названии, составленном по первым буквам генов, у которых впервые была выявлена общая последовательность в 174 нуклеотида: гены МСМ1 (у дрожжей), AGAMOUS (Arabidopsis), Deficiens (у антирринума) SRF (у человека). Однако у животных они не получили развития: дрозофила и нематода имеют только по два MADS-box гена, тогда как у арабидопсиса их 82. К MADS-box генам растений относятся упомянутые выше FLC и API. Гены CLF {CURLYLEAF) и EMF2 (EMBRYONIC FLOWER2) кодируют белки с Polycomb-доменом, которые репрессируют флораль-ные MADS-box гены с В и С областями экспрессии (см. Jack, 2004; Медведев, 2004; Ермаков, 2005): В-гены APETALA3 и PISTILLATA, специфицирующие лепестки, а совместно с С-геном — тычинки, и С-тен AGAMOUS, определяющий пестик. К PcG принадлежит ген ME А, являющийся репрессором MADS-box гена РНЕ1 (Koller et al., 2003). Белки Polycomb-комплекса участвуют также, в геномном импринтинге и в инактивации отцовской Х-хромосомы у самок млекопитающих (Margueron et al., 2005). В последнем случае имеет место транскрипция нетранслируемой РНК гена Xist (Жимулев, 2003). Эта РНК активирует Polycomb-комплекс, который в свою очередь метилирует гистоны НЗ. Белки с Polycomb-доменом, таким образом, являются ключевыми элементами клеточной памяти у животных, растений и грибов.
Метилирование ДНК
Речь идет о ковалентной модификации ДНК, связанной с переносом метильной группы от S-аденозилме-тионина (SAM) на цитозиновый остаток с помощью (ДНК-5)-метилт-рансферазы (Dnmt). Метилируется углерод в пятом положении ароматического кольца. У млекопитающих обычно образуются палиндром-ные метилированные последовательности вида CpG (cytosine-phosphate-guanine), в которых цитозиновые остатки (С) ДНК, отсчитываемые от 5'-конца, предшествуют гуаниновым и связаны с последними фосфатными связями. Реже метилируются последовательности вида CpNpG, где N — любое из четырех азотистых оснований, как правило А(денин) или Т(имин). В геноме млекопитающих 80% этих последовательностей метилированы и большинство их в норме разбросаны (с низкой плотностью) в кодирующей области. У дрозофилы последовательности CpG метилируются как исключение, в основном метилируются последовательности вида СрТ или СрА, причем относительно высокий уровень метилированности отмечен лишь для самых ранних стадий эмбрионального развития, тогда как на поздних, а также у личинок, куколок и взрослых метилированность ДНК держится на очень низком уровне (Lyko, 2001). Метилирование имеет место на обеих нитях ДНК, что важно для воспроизведения меток при клеточных делениях (Goodrich, Tweedie, 2002). У животных Dnmtl участвует в метилировании второй нити ДНК после ее репликации. Dnmt3a и Dnmt3b осуществляют метилирование в эмбриогенезе неметилированной ДНК de novo. У растений известно несколько ДНК-метилтрансфераз: Metl, являющаяся гомологом Dnmtl, хромометилазаЗ (СМТЗ), субстратом для которой служат последовательности CpNpG и CpNpN, и DRM1-2 (Domains Rearranged), которая разделяет гомологию с Dnmt3 (Eckardt, 2006). Многие транскрипционные факторы, такие как АР-2, с-Мус/Муп, CREB, E2F, NFkB распознают последовательности, содержащие CpG-остатки, но не способны связываться с промоторами метилированных генов. Однако в целом метилированность ДНК выборочно влияет на глушение генов, поскольку существуют транскрипционные факторы (Spl, CTF), которые включают гены лишь при условии их метилированности. Так, фактор Spl (Specificity protein 1) включает транскрипцию, соединяясь с промотором SV40 (simian virus 40), но при наличии GC-последовательности. Наконец, многие факторы не имеют сродства с CpG-динуклеотидами. Распределение CpG-динуклеотидов по геному неравномерно. Если иметь в виду геном человека, то различают диспергированные CpG-динуклеотиды и их скопления. Первые характерны для межгенных последовательностей, включающих повторные элементы, перицент-ромерные области. Скопления CpG-динуклеотидов, получившие название CpG-островов, располагаются близ промоторов или первых экзонов 60% генов человека, в основном генов домашнего хозяйства. 80% диспергированных CpG-динуклеотидов, разбросанных по всему геному и не входящих в CpG-острова, обычно сильно метилированы (Davis, Uthus, 2004). Напротив, динуклеотиды в CpG-островах в норме неметилированы. Лишь в особых случаях, например, при импринтинге они метилируются (в одной из хромосом, мужской или женской). В этом случае метилированная ДНК становится мишенью белка МЕСР2 (methyl CpG-binding protein 2), который комплексируясь с рядом других белков (Swi3, HDAC), садится на CpG-острова. Благодаря входящей в комплекс гистон-деацетилазе (HDAC) этот тип метилирования сопряжен с деацетилированием гистонов, что ведет к полному транскрипционному глушению соответствующих генов (Cooper, 2000). МЕСР2, таким образом, является ключевым элементом имп-ринтинга генов. Если в результате мутаций или по другим причинам инактивируется ген МЕСР2, то это ведет к экспрессии импринтиро-ванного гена, т.е. к выработке двойного количества генного продукта. Ген МЕСР2 экспрессируется во многих клетках организма. В нервной ткани его инактивация связана с нервными расстройствами, например, синдромом Ретта. Таким образом, глушение генов может осуществляться в результате прямого метилирования ДНК с помощью метилтрансфераз, катализирующих перенос на ДНК метальных групп, и непрямым путем с помощью особых метил-СрО-связывающих белков, таких как МЕСР2. Поставщиком метальных групп в организме является SAM (S-адено-зилметионин), который вырабатывается из метионина, холина, фоли-евой кислоты, витамина В12. Растения способны поддерживать метилированность ДНК и транс-мейотически. В качестве примера можно привести ген cycloidea из льнянки Linaria vulgaris, который определяет дорсовентральную симметрию цветков у этого и многих других видов (Goodrich, Tweedie, 2002; Колотова и др., 2007). В природе встречаются цветки с радиальной симметрией, которая у льнянки возникает в результате метилирования гена. Способность передавать эпигенетические изменения транс-мейотически отмечена у насекомых и млекопитающих.
Процессы метилирования ДНК и гистонов часто сопряжены. Примером может служить развитие эндосперма у растений. Эндосперм, который обычно содержит два материнских и один отцовский геномы, играет решающую роль в передаче сигналов от материнского растения, являясь в этом смысле аналогом плаценты млекопитающих (Goodrich, Tweedie, 2002). Ключевым в размножении клеток эндосперма является ген РНЕ\ (PHERES1). В женском гаметофите РНЕ\ репрессируется через метилирование гистона НЗ с помощью Polycomb-комплекса, который содержит продукты генов МЕА (MEDEA), FWA, FIS2 (FERTILIZATION-INDEPENDENT-SEED2). В мужском гаметофите эти гены инактивированы в силу метилированное их промоторов. Поэтому РНЕ\ находится в состоянии экспрессии. В женском гаметофите метилированность промоторов отмеченных генов снимается действием гена DME (DEMETER), кодирующего ДНК-гликозилазу (Schubert et al., 2005; Колотова и др., 2007; Kinoshita et al., 2008). После оплодотворения материнский ген МЕА (производный от женского гаметофита) дополнительно репрессируется через метилирование гистона Ро/усо/яб-комплексом, но может быть активирован продуктом гена DDM1 (DECREASE IN DNA METHYLATION1), возможно, через снижение уровня метилированное ДНК. Отмечено также много случаев метилирования генов, которые уже заглушены через модификацию гистонов (Bird, 2002). Это, в частности, показано для случаев инактивации отцовской X-хромосомы у самок млекопитающих, и, по-видимому, имеет целью сделать глушение необратимым. Аналогичным образом клеточная дифференциация в развитии во многих случаях осуществляется через метилирование определенных участков ДНК, в результате чего блокируется или наоборот открывается доступ транскрипционных факторов к гену (Colvis et al., 2005). У млекопитающих описано более пяти ДНК-метилтрансфераз (Dnmt). Эмбрионы мутантных мышей, у которых Dnmtl не проявляет активность, погибают в середине срока беременности со многими нарушениями, особенно большими в производных мезодермы (Meehan, 2003). Метилирование ДНК может индуцировать процессы ковалентной модификации гистонов и преобразования нуклеосом.
Как известно (Кольман, Рем, 2000; Cooper, 2000; Карпов, 2005), компактизация ДНК осуществляется с помощью гистонового октамера, состоящего из гистонов Н2А, Н2В (в виде двух димеров) и НЗ, Н4 (в виде тетрамера). Тетрамер можно представить в виде цилиндра, который с торцовой стороны прикрыт одним из димеров Н2А/Н2В. Вокруг гистонового октамера (длиной 10-11 нм и диаметром 8-10 нм) наматывается двойная цепочка ДНК из 146 пар оснований (п.о.), образующая примерно 1,8 витка. Гистоновый октамер с закрученной вокруг него ДНК называют нуклеосо-мой. Хромосома состоит из большого числа нуклеосом, из которых две соседние связаны линейным (длиной 10-50 п.о., реже больше) участком двойной цепочки ДНК, называемым линкерным. Таким образом 75-90% геномной ДНК связано в нуклеосомах. Линкерная ДНК может быть ассоциирована с негистоновыми белками. Поскольку ДНК не делает два полных оборота, то точка входа линкерного отрезка в нуклеосому и точка выхода из нее следующего отрезка, будут находиться на некотором удалении друг от друга. Эти две точки (вхождения и выхода в нуклеосому линкерных ДНК) связаны между собой опосредованно, через пятый гистоновый белок HI (Kasinsky et al., 2001), получивший название линкерного. Весь комплекс гистонов и ассоциированная с ними ДНК длиной 165 п.о. (с каждой стороны нук-леосомы добавляется по 10 п.о. за счет связи с HI) называют хромато-сомой. Благодаря тому, что между нуклеосомами имеется свободный участок линкерной ДНК, те могут быть плотно упакованы в суперспираль размером 30 нм, формируемой шестью соседними нуклеосомами (Allis et al., 2007). Для объяснения их структурной упаковки предложены две модели — соленоидная и зиг-заг модель. Последние данные свидетельствуют в пользу второй модели (Schlach et al., 2005). 30-нанометровые фибриллы в свою очередь часто упорядочены в спираль следующего уровня (хромонему) шириной 100 нм (Horn, Peterson, 2002). В целом пока не вполне ясно, сколько уровней спирализации характеризуют компактизованную ДНК. Выявлены особые хроматиновые домены, организованные в петли, которые прикрепляются с помощью ламинов к ядерной оболочке. В результате внутреннее пространство ядра распадается на так называемые хромосомные территории, имеющие функциональное значение (Crerner et al., 2006; Heard, Bickmore, 2007; Lanctot et al., 2007; Meaburn, Misteli, 2007). Каждый гистон имеет свободные С- и N-терминальные фрагменты (хвосты). N-хвосты гистонов НЗ и Н4 нависают над спиралью ДНК. Длина хвостов составляет от 15 аминокислот в Н2А до 38 в НЗ (о последовательностях аминокислот в хвостах см. Lund, Lohuizen, 2004). Гистоновые хвосты являются регуляторами активности соответствующих участков ДНК и их регуляторные возможности определяются посттрансляционными изменениями аминокислотных остатков (Strahl, Allis, 2000; Jenuwein, Allis, 2001; Cosgrove, Wolberger, 2005; Mersfelder, Parthun, 2006; Колотова и др., 2007). Ковалентная модификация гистоновых хвостов осуществляется (рис. 8.2) через ацетилирование ли-зиновых остатков, метилирование лизиновых и аргининовых остатков, убиквитинирование лизиновых остатков, фосфорилирование се-риновых и треониновых остатков, а также ADP-рибозилирование остатков глутаминовой кислоты (Peterson, Laniel, 2004). В последние годы (Shiio, Eisenman, 2003; см. также Hilgarth et al., 2004) был открыт еще один механизм модификации гистонов, так называемая СУМО-модификация (или сумоилирование — sumoylation от SUMO: small ubiquitin-related modifier). Реже имеют место процессы гликозилирования, биотинилирования и карбонилирования. Другой параметр модификации гистоновых хвостов связан с числом меток на аминокислотный остаток. Например, е-аминогруппа ли-зинового остатка может соединяться с одной, двумя или тремя метальными группами, гуанидине-аминогруппа аргининового остатка — с одной или двумя метальными группами, которые могут располагаться симметрично или асимметрично (Margueron et al., 2005). Число меток коррелирует с уровнем экспрессии генов. Для конститутивных (постоянных) гетерохроматиновых участков характерно наличие трех метальных групп на лизиновом остатке К9 гистона НЗ (НЗК9, или H3Lys9) и К20 гистона Н4 (Arney, Fisher, 2004; Grewal, Rice, 2004). В пограничных участках между эухроматином и гетерохроматином известен так называемый эффект положения варьирующего типа (PEV — Position-effect variegation) у дрозофилы (см. Жимулев, 2003; Жимулев, Беляева, 2003), выражающийся в глушении эухроматиновых генов, оказавшихся в результате хромосомных перестроек или транспозиции по соседству с гетерохроматиновыми последовательностями. Степень глушения варьирует между клонами клеток. Эффект обусловлен действием ряда генов, выступающих в качестве активатора (гены E(var)s) или супрессора (гены Su(var)s) эффекта (Жимулев, 2003; Cheung, Lau, 2005). Ген Su(var)3-9 у дрозофилы (С1г4 у Schizosaccharomyces pombe) кодирует гистон-метилтрансферазу для метилирования НЗК9. Другой ген Su(var)2-5 кодирует гетерохроматиновый белок НР1, который блокирует метилированные НЗК9, инициируя образование гетерохроматина, а в последующем поддерживая структуру последнего. У S. pombe при формировании гетерохроматина метилтрансфераза С1г4, метилирующая НЗК9, поставляется RITS-комплексом. Мы еще вернемся к этому при рассмотрении малых РНК. Гены, блокированные НР1, будут неактивными. Напротив, реструктурирующий нуклеосому фактор, геликаза CHD1 (Chromodomain helicase DNA binding protein 1), соединяясь с триметилированным Lys4 в хвосте НЗ (НЗК4теЗ), вызывает локальное разуплотнение хроматина. Это состояние в сочетании с общим ацетилированием отличает активно работающие гены. Наконец, в последнее время показана важная роль посттрансляционной модификации коровых (глобулярных) доменов гистонов (Mersfelder, Parthun, 2006). Так для эухроматина наряду с метилированием Lys4 в хвосте НЗ характерно метилирование лизинового остатка Lys79 в глобулярной области НЗ. К настоящему времени описано более 30 подобного рода посттрансляционных изменений. Хроматиновые метки образуют мозаичную картину, специфическим образом меняя свойства гистонов (заряд, гидрофобность, плотность упаковки и др.). При этом меняется сродство нуклеосомы с разными транскрипционными факторами и возможность доступа последних к регуляторным последовательностям ДНК. Некоторые изменения гистоновых хвостов, связанные, прежде всего, с фосфорилирова-нием аминокислотных остатков, играют роль молекулярных переключателей, индуцирующих другие модификации. Структура эпигенетических меток, а также характер их взаимодействия, выражающийся в первую очередь в том, что модификация одного гистонового остатка определяет последующую модификацию в том же самом положении, а нередко и в других, составляет гистоновый код (о правилах гистонового кода см. Margueron et al, 2005). Гистоновый код описывает усойчивые модифицированные состояния гистоновых хвостов, которые являются мишенями хроматин-изменяющих комплексов, действующих для обеспечения определенного профиля экспрессии генов. Гистоновый код определяет транскрипционный спектр, а также влияет на скорость и продолжительность транскрипции, вплоть до ее полной остановки (Jenuwein, Allis, 2001; Pal, Hurst, 2004). Так, фос-форилированию SerlO в НЗ в эухроматиновых участках сопутствует активность ранних генов. Транскрипционная активация также связана с метилированием остатков Arg2, Argl7, Arg26 в НЗ и Arg4 в Н4 (Lachner et al., 2003). Факультативные гетерохроматиновые участки отличаются диметилированием Lys9 гистона НЗ. Определенный спектр хроматиновых меток, до конца не выявленный, делает возможным преобразование нуклеосом с помощью так называемых АТФ-зависимых ремоделирующих комплексов (Allis et al., 2007). Важная роль в АТФ-зависимом преобразовании хроматина принадлежит белковому комплексу SWI/SNF. Этот комплекс изменяет уровень сцепления ДНК с гистонами, делая возможным скольжение нуклеосом относительно друг друга и образование петель нитями ДНК. При этом соответствующий участок ДНК освобождается от излишних контактов для выполнения транскрипционной функции. SWI/ SNF-комплекс при определенных условиях может действовать и как репрессор. Наконец, комплекс способен перемещать нуклеосомы, благодаря чему может стираться метилированность ДНК. Другие АТФ-зависимые нековалентные механизмы участвуют в замещении одних гистонов на другие их варианты. АТФ-зависимые ремоделирующие комплексы наряду с прямой транскрипционной активацией участвуют во многих других внутриядерных процессах, в том числе имеющих непосредственное отношение к механизмам памяти — процессам (де)ацетилирования и поддержания метилированного состояния ДНК (Fyodorov, Kadonaga, 2001; Simone, 2006).
Клеточная память
Структура вновь формируемого хроматина, в том числе модификация гистоновых хвостов и архитектура метилирования ДНК часто определяется строением хроматина материнской клетки. В этих случаях имеет место сохранение структуры хроматиновых меток при клеточных делениях. Если структура хроматиновых меток исходно индуцируется средой, то можно говорить о клеточной памяти. Классическим примером клеточной памяти, основанной на хроматиновых метках, являются процессы яровизации (вернализации) — наличии в жизненном цикле некоторых растений холодовой стадии воздействия на растения низких положительных температур (1-7°С) в течение 1-3 месяцев (см. Медведев, 2004). Только прошедшие эту стадию растения зацветают. Во время весеннего возобновления роста память о том, что растение прошло яровизацию, передается новым клеткам при клеточных делениях, в том числе и тем, которые непосредственно будут формировать генеративные органы. Возбуждение (влияние холода) и ответная реакция (цветение) отделены временным промежутком, который может быть очень большим, например до 300 дней у белены Hyocyamus niger (Goodrich, Tweedie, 2002). Молекулярные механизмы яровизации (данные по Arabidopsis) связаны с изменением хроматиновой структуры гена Flowering locus С (FLC), который в активном состоянии является репрессором цветения. Это изменение начинается с деацетилирования двух лизиновых остатков (К9 и К14) гистона НЗ в результате индуцированной холодом экспрессии гена Vin3 (Vernalization insensitives 3). Как правило, ацетилирование уменьшает взаимодействие гистонов с ДНК, облегчая транскрипцию, а деацетилирование имеет обратный эффект (но у дрожжей деацети-лирование активирует транскрипцию). В итоге создаются условия для метилтрансферазной активности белков, кодируемых генами Vrnl/Vrn2 (Vernalization). Эти белки метилируют лизиновые остатки в 9-м и 27-м положениях гистона НЗ в хроматине FLC (Sung, Amasino, 2004; 2005). Весной с наступлением тепла Vin3 прекращает экспрессию. Метилированные состояния НЗ в хроматине гена FLC устойчиво передаются при клеточных делениях и без участия Vin3. В отсутствие экспрессии FLC начинает работать комплекс генов под общим названием флоральных интеграторов. Таковы гены SOC1 (SUPPRESSOR of OVEREXPRESSION of СONSTANS1или COl) и FT (FLOWERING LOCUS T), регуляция которых определяется также длиной светового дня. Эти гены определяют переход генеративной меристемы в цветковую (Медведев, 2004), активируя гены флоральной идентичности меристемы LEAFY и APETALA1(AP1), которые собственно и запускают процесс цветения. Молекулярная схема яровизации пшеницы известна хуже; вместо FLC репрессором цветения является Vrn2, но каким образом метилируются связанные с ним гистоны неизвестно. Ген Vrnl запускает процесс цветения и функционально соответствует флоральным интеграторам арабидопсиса. Мы упомянули пшеницу лишь по той причине, что ее гены Vrnl/Vrn2 не гомологичны одноименным генам из арабидопсиса (Amasino, 2004; Sung, Amasino, 2005). В рассмотренном примере основу памяти составляет отложенная реакция организма на действие среды. Эта задержка, во-первых, должна выражаться в каких-то молекулярных механизмах. Во-вторых, задержанный ответ организма должен индуцироваться каким-то сре-довым стимулом. В итоге мы имеем следующую схему отложенной во времени реакции организма: действие на организм факторов среды (Fj) —> память об этом действии —> действие среды (F2) —> ответная реакция, основанная на памяти о действии F,. Рассмотрим подробнее механизмы формирования клеточной памяти данного типа.
Polycomb-репрессирующий комплекс
Гены Vml/Vm2 из арабидопсиса кодируют белки, которые имеют гомологи с той же репрессирующей функцией у животных. Все эти и гомологичные белки в других группах объединяются под общим названием белков Polycomb-репрессирующего комплекса (Polycomb repressive complex — PRC, или PC), или Polycomb-группы (PcG). Эти гены кодируют мультипротеи-новые комплексы, ключевую роль в которых играют различные гис-тон-метилтрансферазы (ГМТазы — HMTases). Метилтрансферазы изменяют хроматиновое состояние генов, метилируя лизиновые остатки хвостов гистонов НЗ или Н4, причем метилированные состояния способны передаваться при делении дочерним клеткам. Механизм формирования памяти в этом случае связан с обратимым изменением структуры, имеющим функциональное значение, которое сохраняется некоторое время и может передаваться от клетки к клетке.
У животных эти белки вместе с белками Trithorax-комплекса (Тгх) в процессе развития эмбриона взаимодействуют с гистонами и вызывают наследуемые изменения последних, прекращая или, наоборот, вызывая экспрессию соответствующих генов. У дрозофилы Polycomb-белки участвуют в образовании двух мультипротеиновых комплексов, PRC1 и PRC2 (Orlando, 2003; Levine et al., 2004). Второй комплекс включает метилтрансферазу E(z) [Enhancer of zeste], которая метилирует НЗК9 или (что случается чаще) НЗК27 (Kirmizis et al., 2004). Два других белка ESC [Extra sex combs] и Su(z)12 [Suppressor(12) of zeste] являются модуляторами E(z). В метилировании участвует особый домен SET, названный по первым буквам белков Su(var)3-9, E(z) и Тгх, в которых этот домен был найден. Метилированные гистоны являются мишенью PRC1-комплекса, который связываясь с метилированным НЗК27 блокирует работу соответствующего гена. PRCI-KOM-плекс включает ингибиторы транскрипции Ph [Polyhomeotic] и PSC [Posterior sex combs], белок Рс [Polycomb], который осуществляет непосредственную связь комплекса с метилированными остатками через особый хромодомен (Levine et al, 2004). Из других элементов PRC1-комплекса упомянем белок PHO (Pleiohomeotic), опознающий особую регуляторную последовательность ДНК в промоторе регулируемого гена и известную как PRE (Polycomb response element) или СММ (Cell memory module). У млекопитающих PRE-аналог не был найден. Trx-комплекс является активационным и выступает в качестве своего рода антагониста PRC, выводя гены из состояния заглушенности (Poux et al., 2002). Ключевые белки этого комплекса — Ashl, Su(var)3-9 и Тгх, также являются гистон-метилтрансферазами, но они метилируют лизиновые остатки в других положениях. Например, Ashl и Тгх ГМТазы метилируют НЗК4 и Н4К20; ди- и триметилирование НЗК9 контролируется Su(var)3-9 ГМТазой (Ebert et al., 2004). Итогом является активность соответствующих генов. Отмечена важная роль белков Polycomb-комплекса в репрессии гомеозисных генов, соответственно Нох-генов у животных (по насекомым см. Шаталкин, 2003) и MADS-box генов у растений (Koller, Grossniklaus, 2002; Шаталкин, 2007). У насекомых PRC в норме репрессирует задние Нох-гены в передних отделах тела. Мутации в этих генах ведут к постериоризации сегментов и к формированию в голове и груди признаков, характерных для брюшных сегментов. При умеренных нарушениях происходит частичная трансформация в противоположном направлении. Например, вторая и третья пары ног у Drosophila становятся похожими на первую и у самцов несут половые гребешки (sex combs) на члениках лапок (отсюда название Polycomb). MADS-box гены являются функциональными аналогами Нох-генов. Но они есть и у животных, что отражено в их названии, составленном по первым буквам генов, у которых впервые была выявлена общая последовательность в 174 нуклеотида: гены МСМ1 (у дрожжей), AGAMOUS (Arabidopsis), Deficiens (у антирринума) SRF (у человека). Однако у животных они не получили развития: дрозофила и нематода имеют только по два MADS-box гена, тогда как у арабидопсиса их 82. К MADS-box генам растений относятся упомянутые выше FLC и API. Гены CLF {CURLYLEAF) и EMF2 (EMBRYONIC FLOWER2) кодируют белки с Polycomb-доменом, которые репрессируют флораль-ные MADS-box гены с В и С областями экспрессии (см. Jack, 2004; Медведев, 2004; Ермаков, 2005): В-гены APETALA3 и PISTILLATA, специфицирующие лепестки, а совместно с С-геном — тычинки, и С-тен AGAMOUS, определяющий пестик. К PcG принадлежит ген ME А, являющийся репрессором MADS-box гена РНЕ1 (Koller et al., 2003). Белки Polycomb-комплекса участвуют также, в геномном импринтинге и в инактивации отцовской Х-хромосомы у самок млекопитающих (Margueron et al., 2005). В последнем случае имеет место транскрипция нетранслируемой РНК гена Xist (Жимулев, 2003). Эта РНК активирует Polycomb-комплекс, который в свою очередь метилирует гистоны НЗ. Белки с Polycomb-доменом, таким образом, являются ключевыми элементами клеточной памяти у животных, растений и грибов.
Метилирование ДНК
Речь идет о ковалентной модификации ДНК, связанной с переносом метильной группы от S-аденозилме-тионина (SAM) на цитозиновый остаток с помощью (ДНК-5)-метилт-рансферазы (Dnmt). Метилируется углерод в пятом положении ароматического кольца. У млекопитающих обычно образуются палиндром-ные метилированные последовательности вида CpG (cytosine-phosphate-guanine), в которых цитозиновые остатки (С) ДНК, отсчитываемые от 5'-конца, предшествуют гуаниновым и связаны с последними фосфатными связями. Реже метилируются последовательности вида CpNpG, где N — любое из четырех азотистых оснований, как правило А(денин) или Т(имин). В геноме млекопитающих 80% этих последовательностей метилированы и большинство их в норме разбросаны (с низкой плотностью) в кодирующей области. У дрозофилы последовательности CpG метилируются как исключение, в основном метилируются последовательности вида СрТ или СрА, причем относительно высокий уровень метилированности отмечен лишь для самых ранних стадий эмбрионального развития, тогда как на поздних, а также у личинок, куколок и взрослых метилированность ДНК держится на очень низком уровне (Lyko, 2001). Метилирование имеет место на обеих нитях ДНК, что важно для воспроизведения меток при клеточных делениях (Goodrich, Tweedie, 2002). У животных Dnmtl участвует в метилировании второй нити ДНК после ее репликации. Dnmt3a и Dnmt3b осуществляют метилирование в эмбриогенезе неметилированной ДНК de novo. У растений известно несколько ДНК-метилтрансфераз: Metl, являющаяся гомологом Dnmtl, хромометилазаЗ (СМТЗ), субстратом для которой служат последовательности CpNpG и CpNpN, и DRM1-2 (Domains Rearranged), которая разделяет гомологию с Dnmt3 (Eckardt, 2006). Многие транскрипционные факторы, такие как АР-2, с-Мус/Муп, CREB, E2F, NFkB распознают последовательности, содержащие CpG-остатки, но не способны связываться с промоторами метилированных генов. Однако в целом метилированность ДНК выборочно влияет на глушение генов, поскольку существуют транскрипционные факторы (Spl, CTF), которые включают гены лишь при условии их метилированности. Так, фактор Spl (Specificity protein 1) включает транскрипцию, соединяясь с промотором SV40 (simian virus 40), но при наличии GC-последовательности. Наконец, многие факторы не имеют сродства с CpG-динуклеотидами. Распределение CpG-динуклеотидов по геному неравномерно. Если иметь в виду геном человека, то различают диспергированные CpG-динуклеотиды и их скопления. Первые характерны для межгенных последовательностей, включающих повторные элементы, перицент-ромерные области. Скопления CpG-динуклеотидов, получившие название CpG-островов, располагаются близ промоторов или первых экзонов 60% генов человека, в основном генов домашнего хозяйства. 80% диспергированных CpG-динуклеотидов, разбросанных по всему геному и не входящих в CpG-острова, обычно сильно метилированы (Davis, Uthus, 2004). Напротив, динуклеотиды в CpG-островах в норме неметилированы. Лишь в особых случаях, например, при импринтинге они метилируются (в одной из хромосом, мужской или женской). В этом случае метилированная ДНК становится мишенью белка МЕСР2 (methyl CpG-binding protein 2), который комплексируясь с рядом других белков (Swi3, HDAC), садится на CpG-острова. Благодаря входящей в комплекс гистон-деацетилазе (HDAC) этот тип метилирования сопряжен с деацетилированием гистонов, что ведет к полному транскрипционному глушению соответствующих генов (Cooper, 2000). МЕСР2, таким образом, является ключевым элементом имп-ринтинга генов. Если в результате мутаций или по другим причинам инактивируется ген МЕСР2, то это ведет к экспрессии импринтиро-ванного гена, т.е. к выработке двойного количества генного продукта. Ген МЕСР2 экспрессируется во многих клетках организма. В нервной ткани его инактивация связана с нервными расстройствами, например, синдромом Ретта. Таким образом, глушение генов может осуществляться в результате прямого метилирования ДНК с помощью метилтрансфераз, катализирующих перенос на ДНК метальных групп, и непрямым путем с помощью особых метил-СрО-связывающих белков, таких как МЕСР2. Поставщиком метальных групп в организме является SAM (S-адено-зилметионин), который вырабатывается из метионина, холина, фоли-евой кислоты, витамина В12. Растения способны поддерживать метилированность ДНК и транс-мейотически. В качестве примера можно привести ген cycloidea из льнянки Linaria vulgaris, который определяет дорсовентральную симметрию цветков у этого и многих других видов (Goodrich, Tweedie, 2002; Колотова и др., 2007). В природе встречаются цветки с радиальной симметрией, которая у льнянки возникает в результате метилирования гена. Способность передавать эпигенетические изменения транс-мейотически отмечена у насекомых и млекопитающих.
Процессы метилирования ДНК и гистонов часто сопряжены. Примером может служить развитие эндосперма у растений. Эндосперм, который обычно содержит два материнских и один отцовский геномы, играет решающую роль в передаче сигналов от материнского растения, являясь в этом смысле аналогом плаценты млекопитающих (Goodrich, Tweedie, 2002). Ключевым в размножении клеток эндосперма является ген РНЕ\ (PHERES1). В женском гаметофите РНЕ\ репрессируется через метилирование гистона НЗ с помощью Polycomb-комплекса, который содержит продукты генов МЕА (MEDEA), FWA, FIS2 (FERTILIZATION-INDEPENDENT-SEED2). В мужском гаметофите эти гены инактивированы в силу метилированное их промоторов. Поэтому РНЕ\ находится в состоянии экспрессии. В женском гаметофите метилированность промоторов отмеченных генов снимается действием гена DME (DEMETER), кодирующего ДНК-гликозилазу (Schubert et al., 2005; Колотова и др., 2007; Kinoshita et al., 2008). После оплодотворения материнский ген МЕА (производный от женского гаметофита) дополнительно репрессируется через метилирование гистона Ро/усо/яб-комплексом, но может быть активирован продуктом гена DDM1 (DECREASE IN DNA METHYLATION1), возможно, через снижение уровня метилированное ДНК. Отмечено также много случаев метилирования генов, которые уже заглушены через модификацию гистонов (Bird, 2002). Это, в частности, показано для случаев инактивации отцовской X-хромосомы у самок млекопитающих, и, по-видимому, имеет целью сделать глушение необратимым. Аналогичным образом клеточная дифференциация в развитии во многих случаях осуществляется через метилирование определенных участков ДНК, в результате чего блокируется или наоборот открывается доступ транскрипционных факторов к гену (Colvis et al., 2005). У млекопитающих описано более пяти ДНК-метилтрансфераз (Dnmt). Эмбрионы мутантных мышей, у которых Dnmtl не проявляет активность, погибают в середине срока беременности со многими нарушениями, особенно большими в производных мезодермы (Meehan, 2003). Метилирование ДНК может индуцировать процессы ковалентной модификации гистонов и преобразования нуклеосом.
