Прионы
Раньше считали, что кодируемая генами последовательность аминокислот, автоматически определяет пространственную структуру белка и, следовательно, его функциональные особенности. Далее взаимодействие функциональных белков автоматически задает организацию более сложных систем и на каком-то этапе особенности самих клеток. Взаимодействие последних через опять же генный контроль определяет строение всего организма. Прионы поставили под сомнение эту веру. Функциональность белков во многом задается контекстуально. Конформация и, следовательно, функциональность белков с внутренней неупорядоченностью определяется их взаимодействием с партнерами (Zhang et al., 2007; Dunker et al., 2008). В этих процессах велика роль шаперонов. Это означает, что уже на самом раннем этапе работа генов находится под контролем внешней по отношению к геному регуляторной системы. Свидетельством справедливости этого утверждения служат прионовые болезни. Когда происходит сбой в работе регуляторных механизмов, то белки, имеющие прионовый домен, начинают работать в автономном режиме, индуцируя у вновь синтезируемых белков прионовое состояние (Инге-Вечто-мов и др., 2004; Wickner et al., 2004, 2007). Причем этот вышедший из под контроля процесс прионообразования передается по наследству. Рассуждая аналогичным образом, мы должны заключить, что при регулируемом процессе образования вторичной структуры белка шапероны будут передавать по наследству свою способность индуцировать нормативный фолдинг.
Благодаря исследованиям некодиру-ющих РНК стали вырисовываться контуры еще одной сети, действующей параллельно транскрипционной, но выполняющей лишь регу-ляторные функции. Центральным элементом этой системы являются малые РНК.
В отличие от ДНК молекулы РНК существуют в виде одноцепо-чечных структур. Однако, наличие комплементарных последовательностей ведет к спариванию (гибридизации) последних с образованием линейных двунитевых структур (вторичной структуры). Для вторичной структуры РНК характерны несколько типов пространственных конфигураций (рис. 8.3): стебель, образуемый двуцепочечными спиральными фрагментами (stem, or stacking pair), стеблевые петли (stem loop)i если венчающая стебель петля шире самого стебля, шпильки (hairpin), для обозначения стебля, заканчивающегося узкой петлей (hairpin loop), которая не отличается существенно по ширине от стебля, внутренние петли (internal loop), вздутия (bulge loop). В петлях нуклеотиды не спарены. Стебель (шпилька) может показывать комплементарность и спариваться комплементарными участками с другой шпилькой или с простой нитью с образованием структуры, называемой псевдоузлом (см. Staple, Butcher, 2005). Н-псевдоузлы показывают наиболее простую структуру, характерную, например, для ретровируса обезьян SRV1 (Simian retrovirus 1). Так называемые «целующиеся» шпильки (kissing hairpins) и трехспиралевые Н-псевдоузлы с дополнительной комплементарной связью нитей дают примеры более сложных структур. В последнем случае взаимодействие удаленных участков, как они представлены в двумерной пространственной структуре РНК, ведет к сближению этих участков и формированию трехмерной пространственной организации РНК. Благодаря шпилечным структурам молекулы РНК показывают функциональную близость к белкам. Отметим, что псевдоузлы характерны для прионов и других белковых структур. Известны два типа РНК — матричные, транслируемые в белок, и некодирующие, которые не транслируются в белок. Нетранслируемые РНК могут кодироваться собственными генами, но многие производ-ны от интронов мРНК. Большой класс нетранслируемых ядерных РНК отличается от мРНК отсутствием протяженной открытой рамки считывания (ОРС). Эти РНК подвергаются сплайсингу, полиаденилиро-ванию и часто кэпированию; в ряде случаев они могут характеризоваться короткими ОРС, как например, #айИ7-транскрипты, кодируемые в ответ на ультрафиолетовое облучение и имеющие три коротких ОРС для пептидов длиной 37, 38 и 43 аминокислоты (Erdmann et al., 2000). Эти нетранслируемые РНК называют мРНК-подобными (mRNA-like noncoding RNA). К их числу принадлежит большая группа антисмысловых транскриптов. Антисмысловые транскрипты являются молекулами РНК, последовательность которых комплементарна к другим транскриптам, обозначаемым как смысловые. Они представлены главным образом неко-дирующими РНК, реже кодирующими. Традиционно понятие смыслового транскрипта соотносилось с мРНК, т.е. с транслируемыми в белок последовательностями. В тех случаях, когда оба транскрипта являются одновременно либо кодирующими, либо некодирующими, деление на смысловые и антисмысловые РНК произвольно. Антисмысловые транскрипты можно разбить на две группы: цис- и транс-антисмысловые транскрипты. Первые кодируются на одном и том же локусе, но на разных нитях ДНК. Цис-РНК транскрипты различаются по длине перекрываемых комплементарных последовательностей. При частичной перекрьшаемости комплементарные участки могут быть представлены головными последовательностями, отсчитываемыми от 5' конца, или хвостовыми, отсчитываемыми от 3' конца. В процентном отношении перекрывающиеся транскрипты составляют 22% от общего числа транскриптов в геноме человека, 29% в геноме мыши. Трансантисмысловые транскрипты — кодируются на разных хромосомных локусах. Смысловой и комплементарный к нему антисмыс-ловой транскрипты образуют транскрипционную пару. Возможны некомплементарные транскрипционные пары, если, например, РНК-транскрипт соответствует интрону, транскрибируемому с другой нити ДНК (Kiyosawa et al., 2003; Werner, Berdal, 2005). Регуляторные функции антисмысловых транскриптов осуществляются через разные механизмы. При их спаривании с пре-мРНК с образованием дуплекса ограничиваются возможности соединения сплай-осом с пре-мРНК и, как результат, ограничиваются возможности удаления некоторых интронов. Другим механизмом является транскрипционная интерференция: изменение, в том числе и через подавление, одного транскрипционного процесса другим. Два типа некодирующих РНК участвуют на заключительных этапах белкового синтеза — в процессах трансляции, имеющих место в цитоплазме. Таковы рибосомные РНК (рРНК), комплексирующиеся вместе с белками в рибосомы, и транспортные РНК (тРНК — 70-95 нуклеотидов), участвующие в переносе аминокислот во время синтеза белковой цепи (подробнее см. Мушкамбаров, Кузнецов, 2003; Cooper, 2000). Ядерные РНК (мяРНК — snRNA: 100-300 нуклеотидов у человека) контролируют процессы сплайсинга. Они вместе с ферментами, катализирующими вырезание интронов, формируют особые структуры, называемые сплайосомами. Ядрышковые РНК (мяоРНК- snoRNA: 50-200 нуклеотидов), спариваясь с другими РНК, регулируют изменения последних, в частности 2'-0 метилирование рибозы у рибосом-ных РНК и псевдоуридилирование (замещение уридина на псевдоури-дин) у мяРНК. Некоторые мяоРНК осуществляют процессинг пре-рРНК, разрезая ее на конечные рибосомные компоненты 18S (ок 2000 н.), 5,8S (155 н.) и 28S (ок. 4000 н.). RNase P и RNase MRP РНК, входящие в рибонуклеопротеиновые комплексы являются эндорибонукле-азами, функция которых связана с удалением определенных последовательностей из РНК. Первый из них отрезает у предшественника тРНК его неспаренный в шпильку 5' конец. Аналогичную операцию удаления неспаренного 3' конца осуществляет белок, входящий в данный рибонуклеопротеиновый комплекс. Теломеразная РНК (ок. 450 н.) и связанная с ней в единый теломеразный комплекс обратная транс-криптаза осуществляют удлинение теломер, добавляя к концам эука-риотических хромосом G-богатые теломерные повторы. Некодирующие РНК выполняют и многие другие повседневные внутриклеточные функции. SRP (signal recognition particle) РНК образует рибонуклеопротеиновый комплекс из шести полипептидов и одной молекулы РНК (ок. 300 нуклеотидов), обозначаемой 7SLPHK. Этот комплекс контролирует потоки белков в эндоплазматическом ретикулуме. В последнее время была выявлена большая группа некодирующих РНК, выполняющих регуляторные функции. Среди последних различают малые нкРНК, размеры которых не превышают 200 (по более ранним классификациям 500) нуклеотидов (Costa, 2005; Huttenhofer, Schattner, 2006; Макарова, Крамеров, 2007), и длинные нкРНК. Длинные нкРНК контролируют ДНК-последовательности, соседние с теми, с которых эти РНК транскрибируются. Наиболее изученными среди них являются нкРНК-гены Xist и Tsix, участвующие в инактивации Х-хромосомы (Жимулев, 2003; Лавров, Кибанов, 2007). Считывание мРНК-генов с отцовской Х-хромосомы подавляется экспрессией Xist, в то же время экспрессия Xist на материнской хромосоме X подавляется при участии гена Tsix, имеющего антисмысловую транскрипционную направленность. Мутация в Tsix приводит к экспрессии гена Xist и к инактивации материнской Х-хромосомы. У Drosophila аналогом Xist является нкРНК-ген гоХ, выступающий в качестве ключевого элемента в дозовой компенсации Х-хромосомы (Жимулев, 2003; Лавров, Кибанов, 2007; Bal et al, 2007).
Геномный импринтинг
Рассмотрим подробнее работу нкРНК на примере процессов импринтинга ряда мышиных генов. Большинство генов экспрессируется с обеих гомологичных хромосом (биаллельная экспрессия). Некоторые гены, однако, считываются с какой-то одной хромосомы, попадающей в зиготу либо от отца, либо от матери. В этом случае говорят о моноаллельной экспрессии. Такие гены, очевидно, различаются по своему функциональному состоянию, и это должно находить выражение в их специфическом изменении, свидетельствующем либо об их отцовском происхождении, либо материнском (Сапиенца, 1990; Паткин, Сучкова, 2006). Соответствующие гены называют импринтированными (т. е. несущими отпечаток, молекулярный импринт). Молекулярное мечение генов обычно связано с метилированием ДНК, реже гистонов и этот процесс называют импринтингом. У мыши выявлено около 80 генов, подвергающихся импринтингу. Реальное их число безусловно больше, по некоторым оценкам может исчисляться несколькими сотнями; указывался, в частности, верхний порог в 600 генов (Wood, Oakey, 2006). Импринтиро-ванные гены обычно собраны в кластеры по 3-15 генов, из которых по меньшей мере один кодирует нкРНК, остальные — белок (Pauler, Barlow, 2006; Pauler et al., 2007). Последовательности внутри гомологичных кластеров, различающиеся по метилированию, называют дифференциально метилируемыми доменами (или районами) — Differentially methylated domains (regions), DMD или DMR. Внутри DMD выделяют цисдействующую последовательность, через которую запускаются процессы импринтинга. Эту последовательность называют импринтинг-контролирующим элементом (ICE — Imprinting Control Element) или центром импринтинга. Примерно половина импринтированных генов мыши расположены в седьмой хромосоме, в которой они сгруппированы в пять кластеров (Wood, Oakey, 2006). На рисунке гены, считываемые с материнской хромосомы, записаны слева; гены, считываемые с отцовской хромосомы, изображены с правой стороны. Гены некодирующих РНК заключены в рамку. Отметим одну важную особенность импринтированных генов. При метилировании ICE имеет место экспрессия белок-кодирующих генов и репрессия связанной с этим комплексом нкРНК, которая однако экспрессируется с гомологичной хромосомы (материнской или отцовской). В неметилированных ICE имеет место обратное соотношение (Pauler, Barlow, 2006). Например, кластер Kcnql содержит девять генов, кодирующих мРНК, которые лежат по обе стороны от гена Kcnql otl (£c/j#/overlapping transcript 1), кодирующего нкРНК. Последний ген считывается с отцовской хромосомы. Его промотор, включающий ICE-последовательность, расположен в десятом интроне гена Kcnql, но имеет антисмысловую ориентацию. Экспрессия гена Kcnql otl необходима для глушения всех соседних девяти мРНК-генов, образующих по данной особенности функциональный кластер. Кластер назван по гену Kcnql, который кодирует калиевый трансмембранный канал подсемейства KQT—Potassium voltage-gated channel KQT-like subfamily 1. Таким образом, с отцовской хромосомы ген Kcnqlotl считывается, а связанные с ним гены молчат. Напротив, в материнской хромосоме ген Kcnqlotl метилирован и не транскрибируется. Как результат, он не репрессирует соседние с ним гены, и они считываются (Pauler, Barlow, 2006; Pauler et al., 2007; Mohammad, 2008; Pandey et al., 2008; Wu, Bernstein, 2008). В рассматриваемом кластере седьмой хромосомы мыши все гены имеют моноаллельную экспрессию. В геноме человека соответствующий кластер расположен в хромосоме 11. Этот кластер отличается от мышиного тем, что внутри него находится ген Phemx с биаллельной экспрессией. Остальные гены имеют моноаллельную экспрессию. Сходные отношения имеют место и в другом важном кластере Ig/2. Есть, правда, существенные различия. Ген Ig/2 (Insulin-like growth factor) считывается с отцовской хромосомы и кодирует инсулин-подобный фактор роста, который активен в мезодермальных и энтодер-мальных тканях в период эмбрионального развития (Паткин, Сучкова, 2006; Delaval et al., 2006; Ридли, 2008). Этот ген имеет альтернативные промоторы (Р0, Р,, Р2, Р3). Р0-/§/2-транскрипты считываются в трофобластах лабиринта плаценты и регулируют плацентарный рост. Соответственно экспрессия Igf2 на отцовской хромосоме стимулирует поступление питательных веществ в плод, тогда как гены Ipl и p57Kip2 ограничивают питание эмбриона (Isles, Holland, 2005). У человека избыточная экспрессия гена IGF2, расположенного в хромосоме 11, ведет к синдрому Беквита-Видемана, сопровождающемуся переразвитием сердца и печени (Ридли, 2008). Другой ключевой ген кластера HI 9 (Hepatic cDNA clone 19) расположен ниже reHa/g/2, а также второго гена кластера /ns2(Insulin2) и кодирует нкРНК. ICR-область, регулирующая активность гена HI 9, расположена вне этого гена, между ним и генами Ig/2 и Ins2. Ген Н19 считывается с материнской хромосомы и подавляет все связанные с ним белок-кодирующие гены кластера. В отцовской хромосоме ICR-область гиперметилируется во время сперматогенеза, что ведет к инактивации промотора гена HI 9 и, как результат, транскрипционной активности генов Ig/2 и Ins2. В материнской хромосоме DMD-область гипометилирована. Поэтому активен промотор гена HI9, а сам ген транскрибируется. Одновременно гипометилированная DMD-область функционирует как инсу-латор, который взаимодействует с СССТС-связывающим фактором (CTCF). Как результат, блокируется связь промоторов генов Igf2 и Ins2, что ведет к их транскрипционной инактивации.
Поскольку инактивация гена Н19 связана с метилированием ICR-области, то недостаток метальных групп способен снизить транскрипционную активность гена Ig/2 у эмбриона, что должно иметь негативные последствия у взрослого человека. Этот вывод нашел подтверждение в результатах обследования голландских граждан, зачатых в последний год второй мировой войны, когда беременные женщины голодали. У родившихся детей была снижена активность Ig/2, что привело к увеличению у них по достижении взрослого состояния частоты онкологических заболеваний, прежде всего рака толстой и прямой кишки. ICR-область с межгенной локализацией отличает и другие мРНК-гены, импринтируемые по отцовской линии (импринтинг устанавливается в сперматозоиде). Таковы гены Dlk (Delta-like l homologue), действующий в связке с геном нкРНК Gtl, и Rasgrfl, взаимодействующий с геном нкРНК А19 (Delaval et al., 2006; Wood, Oakey, 2006). Импринтированное состояние может различаться у гомологичных генов мыши и человека. Хорошо изученным примером является кластер Igf2r (Tg/2-рецептор), расположенный в хромосоме 17 мыши и включающий еще два мРНК-гена — Slc22a2 и Slc22a3, кодиру-ющих транспортеры органических катионов (Morison et al., 2005; Pauler et al., 2007). Эти гены показывают материнскую экспрессию. Регуля-торную функцию выполняет нкРНКЛ/г, считываемая с отцовской хромосомы. Промотор Л//--гена расположен в интроне Igf2r и показывает антисмысловую ориентацию. Транскрипт этого гена частично пересекается с Igf2r транскриптом. В этом отношении Air показывает сходство с Kcnqlotl. Оба гена способны к цис-глушению входящих в соответствующие кластеры мРНК-генов. У человека гены IGF2R и SLC22A2-3 расположены в хромосоме 6. Первый из этих генов кодирует рецептор для устранения избытка IGF2 белка, который, соединяясь с рецептором, подвергается распаду. Существенно, что AIR-тея в геноме человека не выявлен. Таким образом, в отличие от мыши, гены IGF2R и SLC22A2-3 имеют биаллельную экспрессию, установившуюся в качестве реверсии (возврата к исходному состоянию, характерному для птиц и однопроходных) у представителей Euarchonta (тупайи, лемуры, обезьяны и человек) (Vu et al., 2006). У млекопитающих импринтированные гены участвуют в процессах эмбрионального развития. Причем материнские гены действуют на него негативно, замедляя, например, рост, тогда как отцовские гены, наоборот, ускоряют развитие. Если мы возьмем гены Ig/2 и Ig/2r> продукты которых взаимодействуют в период эмбрионального развития, то уменьшение экспрессии первого из этих генов (отцовского) ведет к ограничению внутриматочного роста. Уменьшение экспрессии второго (материнского) гена имеет обратный эффект (Isles, Holland, 2005). Отметим одну важную особенность импринтированных генов. При метилировании ICE имеет место экспрессия белок-кодирующих генов и репрессия нкРНК и наоборот (Pauler, Barlow, 2006).
Малые некодирующие РНК
Малые РНК могут быть сгруппированы по размеру, структуре, ключевым мотивам, функции и ряду других признаков. Особая роль в процессах регуляции принадлежит двум типам малых некодирующих РНК: микроРНК (miRNA) и интерферирующим РНК (миРНК — siPHK). Оба типа, включающие от 20 до 28 нуклеоти-дов, различаются по генезису (Bartel, 2004; Омельянчук и др., 2005; Axtell, Bartel, 2005; Kim, 2005 a,b; Chopra, Mishra, 2006). siPHK (21-28 нуклеотидов) образуются из длинных двуцепочечных РНК, расщепляемых на короткие отрезки РНКазой III, называемой Dicer. Они могут появляться в клетке экзогенно, как ответная реакция на внедрение в клетку вирусных РНК, которые разрезаются на двунитевые фрагменты, и эндогенно для обеспечения собственных регуляторных процессов (Mathieu, Bender, 2004). Эндогенные siPHK делят на три подкласса (Kim, 2005b): (1) транс-действующие siPHK (tasiPHK — 21-22 нуклеотида), кодируемые у растений из межгенных участков; (2) ассоциированные с повторами молекулы (rasiPHK — 24-27 нуклеотидов) и (3) сканирующие siPHK (scnPHK: 28 нуклеотидов), участвующие в перестройках ДНК и известные у Tetrahymena thermophila. Эндогенные двуцепочечные siPHK образуются в результате встречной экспрессии комплементарных нитей ДНК, отвечающих соответствующему «гену». Образующиеся транскрипты от сестринских последовательностей ДНК процессируются до двуцепочечных предположительно с помощью РНК-зависимой РНК-полимеразы. tasiPHK известны у растений и нематоды Caenorhabditis elegans; у насекомых и позвоночных не найдены. У дрожжей rasiPHK могут подавлять транскрипцию повторных подвижных элементов. Предшественник scnPHK через встречную экспрессию синтезируется в микронуклеусе. После расщепления Dicer-подобной РНКазой и образования scnPHK последние диффундируют в материнский макронуклеус, переходя далее в дочерний макронуклеус, в котором они включаются в комплекс RITS (RNA-induced initiation of transcriptional gene silencing). Этот комплекс участвует в метилировании гистонов — условие, необходимое для элиминации ДНК в макронуклеусе цилиат. В других случаях siPHK через РНК-связываю-щий фактор Argonaute комплексируется с многокомпонентной эндонук-леазой RISC. Комплекс часто включает РНК-зависимую РНК-полиме-разу, которая синтезирует двуцепочечные dsPHK по одноцепочечным (ssPHK). Клеточная функция комплекса связана с разрушением гомологичных РНК в цитоплазме и нацелена на освобождение клетки от чужеродных, главным образом, вирусных РНК, а также поврежденных транс-криптов и транскриптов, в которых клетка более не нуждается. МикроРНК образуются из транскриптов, т.е. однонитевых мРНК-предшественников (70-200 нуклеотидов длиной), кодируемых неканоническими «генами». В дуплексе микроРНК частично спарена с нитью, обозначаемой микроРНК. Далее микроРНК комплексиру-ется с многокомпонентной эндонуклеазой RISC (RNA induced silencing complex), включающей наряду с Dicer и TRBP, РНК-связывающий фактор Argonaute. Комплекс часто включает РНК-зависимую РНК-по-лимеразу, которая синтезирует двунитевые dsPHK по однонитевым (ssPHK). РНК-субъединицы в этом комплексе могут взаимодействовать с комплементарной последовательность матричной РНК, обычно не превышающей шести-восьми нуклеотидов. При эндонуклеаз-ной активности соответствующего каталитического комплекса RISC этот последний либо расщепляет мРНК, либо подавляет трансляцию. У растений механизм работы микроРНК при разделении матричной РНК аналогичен таковому siPHK. Напротив, у млекопитающих микроРНК связывается с З'-нетранслируемым участком (см. Mignone et al., 2002; Мушкамбаров, Кузнецов, 2003) матричной РНК, закрывая доступ последней к активным сайтам рибосом. Кроме этих двух классов существуют еще несколько слабо изученных малых РНК (Kuwabara et al., 2004; Kim, 2005b): сверхмалые (tiny non-coding — tncPHK: 20 нуклеотидов) и малые модулярные (smPHK: 20 нуклеотидов). синтезируются во всех типах В последние годы выявлена ключевая роль еще одного класса малых РНК, так называемых пиРНК (piRNA) (Ют, 2006; O'Donnell, Boeke, 2007). Они длиннее микроРНК и в этом отношении более близки к rasiPHK. Большинство из них сконцентрировано в ограниченных по длине локусах и транскрибируется с какой-то одной нити ДНК. 17% пиРНК млекопитающих связаны с повторяющимися последовательностями. В клетке малые РНК выполняют разнообразные функции, спектр которых, последовательность выполнения и характер взаимодействия меняются в зависимости от внешних и внутренних сигналов. Их важнейшая регуляторная функция связана с ферментативным разрушением или инактивацией транскриптов и других подлежащих уничтожению РНК-молекул, о чем уже было сказано. Наряду с этим у эукариот нетранслируемые РНК, включая и большие, кодируемые, например, геном Xist (Жимулев, 2003), являются важнейшим инструментом эпигенетического изменения ДНК и гистонов хроматина (Bernstein, Allis, 2005). Так, сРНК, комплексированные с метилтрансферазами, участвуют в метилировании ДНК (Mathieu, Bender, 2004) и в модификации гистонов (у растений и грибов), причем эти изменения при определенных обстоятельствах могут передаваться мейотически (Richards, 2006). Метилирование ДНК осуществляется через dsPHK-зависимый ДНК-метилирующий комплекс памяти (dsRNA-dependent DNA methy-lation complex). siPHK, связанные с этим и другими системами клеточной памяти могут запускать de novo процесс метилирования гомологичных последовательностей ДНК (Mathieu, Bender, 2004; Matzke, Birchler, 2005). Причем цитозин может метилироваться во всех сочетаниях, не только в виде CpG-динуклеотида. При метилировании гистонов (обычно лизина 9 гистона НЗ) (Matzke, Birchler, 2005) siPHK соединяется с Argonaute, но внутри другого белкового комплекса RITS, заякоренного на хроматине с помощью хромодоменного белка Chpl (Grewal, Rice, 2004). Это один из ключевых процессов образования гетерохро-матина. Перемещение малых РНК от источника в другие клетки может и в них вызывать глушение соответствующих генов (Pal, Hurst, 2004). Это показано для растений, у которых малые РНК с помощью специальных белков способны распространяться через сосудистую систему (Yoo et al., 2004), а из животных — для нематоды С. elegans. МикроРНК известны лишь у многоклеточных организмов и регулируют многие ключевые биологические процессы, включая клеточный рост, пролиферацию клеток, их апоптоз, развитие и дифференциацию, поддержание дифференцированного состояния клеточных линий. Дисфункция даже одной микроРНК может вызвать рак у мыши (Costinean et al., 2006). Снижение уровня miR-15a и miR-16-l коррелирует с развитием хронической лимфоцитарной лейкемии. Недифференцированные клетки, в которых инактивирована РНКаза Dicer, хотя и живут, но не способны к дифференциации (Negrini et al., 2007). У позвоночных 80% высококонсервативных микроРНК оказались тка-неспецифичными. Специфичные микроРНК выделены у млекопитающих из сердца (miR-1), печени (miR-122), из гранулоцитов и макрофагов (miR-223) клеток мозга и других органов (Battel, 2004). По существу, каждый клеточный тип на каждой стадии развития животных имеет свой профиль экспрессии микроРНК. Для клеточных типов характерна высокая плотность специфических микроРНК. Например, у взрослой нематоды С. elegans miR-2, miR-52 и другие микроРНК представлены в среднем более 50 тысячами молекул на клетку; реже микроРНК показывают низкую плотность, как например, miR-124, среднее содержание которой составляет всего лишь 800 молекул на клетку.
В качестве генетического регулятора микроРНК функционирует как главный посттранскрипционный репрессор. У млекопитающих выявлено чуть больше 300 микроРНК (Landgraf et al., 2007), мишенями которых, как показывает компьютерный анализ, являются тысячи генов (одна треть всех генов человека). Одна микроРНК может иметь от 100 до 200 разных мРНК в качестве мишеней.
Малые РНК как независимые регуляторы клеточной жизни
Малые РНК обеспечивают второй уровень регуляции экспрессии ДНК. Первый, имеющийся и у прокариот обеспечивается регуля-торными белками.
Одним из механизмов этой регуляции является ферментативное разрушение транскриптов и других подлежащих уничтожению РНК-молекул. Роль малых РНК сводится к мечению последних через гомологичное спаривание. Для этого они комплексируются с белками, включающими ферменты и связывающие белки. Например, клеточная функция миРНК, связанная с разрушением гомологичных РНК в цитоплазме, нацелена на освобождение клетки от чужеродных, главным образом, вирусных РНК, а также поврежденных транскриптов. У животных имеет место механическое глушение мРНК без ее разрыва (Sontheimer, Carthew, 2005). Напротив, у растений при нахождении, например вирусной РНК, имеющей фрагмент, гомологичный с siPHK, эндонуклеаза RISC делает разрыв вирусной РНК в середине гомологичной последовательности. Этот процесс называют РНК-ин-терференциией (RNA interference — RNAi). В ряде исследований (Battel, 2004; Taatjes et al., 2004; Pasquinelli et al., 2005) было показано, что малые РНК у многоклеточных организмов контролируют временную последовательность транскрипционных событий и упорядоченность последних в пространстве. Первая выявленная у нематоды С. elegans микроРНК (lin-4) оказалась переключателем развития (отсюда название этой и других подобных РНК как stPHK — small temporal). Связываясь с З'-нетранслируемым участком, она инактивирует мРНК гена Нп-14 при переходе от первой ко второй стадии личиночного развития (Lim et al., 2003). Примером пространственных переключателей могут служить у той же нематоды miR-273 и Isy-б, являющиеся трансляционными репрессорами ключевых транскрипционных факторов в нейронах, расположенных с правой и левой сторон (Johnston, Hobert, 2003). Соответствующие закономерности были выявлены и для других животных, в последующем также и для растений (Aukerman, Sakai, 2003). Из других функций некодирующих малых РНК отметим их участие в редактировании РНК, а также ДНК (используя обратную транскрипцию) и их способность связывать белки и перемещать последние в нужное место (Brosius, 2005). Малые РНК могут использоваться в качестве платформы, связывающей функциональные белки. Упомянем SRP РНК-частицу, которая одновременно является кофактором каталитической активности удерживаемых ею белков. Эти и другие функции некодирующих РНК определяют возможность контроля основных клеточных процессов, связанных с ростом, делением, дифференциацией и регулируемой смертью (апоптозом) клеток. Например, микроРНК образуют в клетке разветвленную регуляторную сеть, в которой некоторые молекулы в состоянии взаимодействовать с сотнями матричных РНК. В то же время одна матричная РНК может зависеть от многих микроРНК (Hornstein, Shomron, 2006). У растений и животных инактивация Dicer или Argonaute ведет к остановке развития и гибели эмбрионов (Pasquinelli et al., 2005). С другой стороны известны примеры, когда инактивация микроРНК-генов не имеет катастрофических последствий. Отсюда возникло мнение, что малые РНК обеспечивают тонкую настройку работы транскрипционных сетей. Не отрицая этого, все же следует не сбрасывать со счетов еще одну возможность: отмечаемая в ряде примерах нечувствительность транскрипционных сетей (Lai, 2005) может быть связана с участием в их работе большого числа малых РНК, что и позволяет компенсировать частичную потерю транскрипционной активности. Сочетание некодирующих РНК, характерных для разных типов клеток, было предложено называть риботипами (Herbert, 2004). Риботипы отличаются спецификой (профилем) выполняемых им функций. Как-системы регуляции они способны к репликации и поэтому составляют еще один источник наследственности наряду с каноническими генами.Для чего необходима вторая регуляторная система, основанная на малых РНК (риботипах), в дополнение к регуляторным механизмам через систему транскрипционных факторов и сигнальных молекул? Этот вопрос обсуждался многими авторами. Здесь мы остановимся на позиции Маттика (Mattick, 2004; Маттик, 2005; Mattick, Makunin, 2006). Теоретический и предметный анализ регулируемых систем в разных областях науки показал, что при усложнении объекта информационное обеспечение регуляторного (управляющего) контура должно расти нелинейно и часто выражается почти квадратичной зависимостью. Если на каком-то этапе эволюции организмы еще и могли существовать за счет совершенствования авторегуляции в генных (транскрипционных) сетях, то по достижении некоторого уровня сложности возможность дальнейшего прогресса требовала создания принципиально новой автономной регуляторной системы, действующей на независимой материальной основе. Маттик, ссылаясь на математические расчеты, считает, что переход от прокариот к эукариотам как раз и был связан с качественным изменением уровня организационной сложности. Эукариоты, следовательно, и являются объектом приложимости новой концепции наследственности. У многоклеточных животных на работу внутриклеточной транскрипционной сети накладываются регуляторные процессы, связанные, во-первых, с дифференциацией клеточных типов по мере роста клеточной массы, а, во-вторых, с регуляцией пространственно-временных отношений, определяющих последовательность развертывания транскрипционной сети. Иными словами, транскрипционная динамика у эукариот оркестрируется необычайно сложной системой ре-гуляторных некодирующих РНК, которые составляют более 90% от суммарного транскрипционного выхода генома человека. О том, что РНК может быть независимым от ДНК носителем наследственности показано в недавних опытах на линии мышей, мутантных по гену Kit. Этот ген кодирует цитокиновый Kit-рецептор с про-теинтирозин-киназной активностью. Kit-рецептор является ключевым элементом в процессах дифференциации зародыша, кроветворения и меланизации . TmlAlf-мутацш (Kit TmlAlf, первоначально как KitW-LacZ), при которой синтез Kit-рецептора невозможен, вызывает у гомозигот смерть сразу после рождения. Гетерозиготы выживают, но имеют особенный фенотип, отличающийся белым кончиком хвоста и белыми лапами. В потомстве от скрещивания гетерозигот (Kit+А) между собой, а также с нормальными особями (KU+/+) большинство особей имело белый хвост и белые лапы. Существенно, что этот фенотип проявился и у генетически нормальных (KU+/+) потомков. В то же время не отмечалось гибели гомозиготных потомков (Rassoulzadegan et al., 2006). Налицо нарушение менделевских законов. Далее было показано, что инъекция РНК, полученной из Kit TmlAlf гетерозигот, в одноклеточный эмбрион, нормальный по Kit-тещ, ведет к мутантному фенотипу. Оказалось, что и сперма может передавать через РНК функциональную информацию. Это означает, что РНК независимо от ДНК может передавать наследственную информацию в ряду поколений. Механизмы такой передачи не совсем ясны. Предполагают, что процесс размножения испорченной РНК осуществляется по типу воспроизведения прионов: испорченные РНК «портят» новые РНК, транскрибируемые немутантным аллелем Kit. Во всяком случае через этот механизм происходит сохранение специфической РНК при формировании долговременной памяти.
Раньше считали, что кодируемая генами последовательность аминокислот, автоматически определяет пространственную структуру белка и, следовательно, его функциональные особенности. Далее взаимодействие функциональных белков автоматически задает организацию более сложных систем и на каком-то этапе особенности самих клеток. Взаимодействие последних через опять же генный контроль определяет строение всего организма. Прионы поставили под сомнение эту веру. Функциональность белков во многом задается контекстуально. Конформация и, следовательно, функциональность белков с внутренней неупорядоченностью определяется их взаимодействием с партнерами (Zhang et al., 2007; Dunker et al., 2008). В этих процессах велика роль шаперонов. Это означает, что уже на самом раннем этапе работа генов находится под контролем внешней по отношению к геному регуляторной системы. Свидетельством справедливости этого утверждения служат прионовые болезни. Когда происходит сбой в работе регуляторных механизмов, то белки, имеющие прионовый домен, начинают работать в автономном режиме, индуцируя у вновь синтезируемых белков прионовое состояние (Инге-Вечто-мов и др., 2004; Wickner et al., 2004, 2007). Причем этот вышедший из под контроля процесс прионообразования передается по наследству. Рассуждая аналогичным образом, мы должны заключить, что при регулируемом процессе образования вторичной структуры белка шапероны будут передавать по наследству свою способность индуцировать нормативный фолдинг.
Некодирующие РНК
Благодаря исследованиям некодиру-ющих РНК стали вырисовываться контуры еще одной сети, действующей параллельно транскрипционной, но выполняющей лишь регу-ляторные функции. Центральным элементом этой системы являются малые РНК.
В отличие от ДНК молекулы РНК существуют в виде одноцепо-чечных структур. Однако, наличие комплементарных последовательностей ведет к спариванию (гибридизации) последних с образованием линейных двунитевых структур (вторичной структуры). Для вторичной структуры РНК характерны несколько типов пространственных конфигураций (рис. 8.3): стебель, образуемый двуцепочечными спиральными фрагментами (stem, or stacking pair), стеблевые петли (stem loop)i если венчающая стебель петля шире самого стебля, шпильки (hairpin), для обозначения стебля, заканчивающегося узкой петлей (hairpin loop), которая не отличается существенно по ширине от стебля, внутренние петли (internal loop), вздутия (bulge loop). В петлях нуклеотиды не спарены. Стебель (шпилька) может показывать комплементарность и спариваться комплементарными участками с другой шпилькой или с простой нитью с образованием структуры, называемой псевдоузлом (см. Staple, Butcher, 2005). Н-псевдоузлы показывают наиболее простую структуру, характерную, например, для ретровируса обезьян SRV1 (Simian retrovirus 1). Так называемые «целующиеся» шпильки (kissing hairpins) и трехспиралевые Н-псевдоузлы с дополнительной комплементарной связью нитей дают примеры более сложных структур. В последнем случае взаимодействие удаленных участков, как они представлены в двумерной пространственной структуре РНК, ведет к сближению этих участков и формированию трехмерной пространственной организации РНК. Благодаря шпилечным структурам молекулы РНК показывают функциональную близость к белкам. Отметим, что псевдоузлы характерны для прионов и других белковых структур. Известны два типа РНК — матричные, транслируемые в белок, и некодирующие, которые не транслируются в белок. Нетранслируемые РНК могут кодироваться собственными генами, но многие производ-ны от интронов мРНК. Большой класс нетранслируемых ядерных РНК отличается от мРНК отсутствием протяженной открытой рамки считывания (ОРС). Эти РНК подвергаются сплайсингу, полиаденилиро-ванию и часто кэпированию; в ряде случаев они могут характеризоваться короткими ОРС, как например, #айИ7-транскрипты, кодируемые в ответ на ультрафиолетовое облучение и имеющие три коротких ОРС для пептидов длиной 37, 38 и 43 аминокислоты (Erdmann et al., 2000). Эти нетранслируемые РНК называют мРНК-подобными (mRNA-like noncoding RNA). К их числу принадлежит большая группа антисмысловых транскриптов. Антисмысловые транскрипты являются молекулами РНК, последовательность которых комплементарна к другим транскриптам, обозначаемым как смысловые. Они представлены главным образом неко-дирующими РНК, реже кодирующими. Традиционно понятие смыслового транскрипта соотносилось с мРНК, т.е. с транслируемыми в белок последовательностями. В тех случаях, когда оба транскрипта являются одновременно либо кодирующими, либо некодирующими, деление на смысловые и антисмысловые РНК произвольно. Антисмысловые транскрипты можно разбить на две группы: цис- и транс-антисмысловые транскрипты. Первые кодируются на одном и том же локусе, но на разных нитях ДНК. Цис-РНК транскрипты различаются по длине перекрываемых комплементарных последовательностей. При частичной перекрьшаемости комплементарные участки могут быть представлены головными последовательностями, отсчитываемыми от 5' конца, или хвостовыми, отсчитываемыми от 3' конца. В процентном отношении перекрывающиеся транскрипты составляют 22% от общего числа транскриптов в геноме человека, 29% в геноме мыши. Трансантисмысловые транскрипты — кодируются на разных хромосомных локусах. Смысловой и комплементарный к нему антисмыс-ловой транскрипты образуют транскрипционную пару. Возможны некомплементарные транскрипционные пары, если, например, РНК-транскрипт соответствует интрону, транскрибируемому с другой нити ДНК (Kiyosawa et al., 2003; Werner, Berdal, 2005). Регуляторные функции антисмысловых транскриптов осуществляются через разные механизмы. При их спаривании с пре-мРНК с образованием дуплекса ограничиваются возможности соединения сплай-осом с пре-мРНК и, как результат, ограничиваются возможности удаления некоторых интронов. Другим механизмом является транскрипционная интерференция: изменение, в том числе и через подавление, одного транскрипционного процесса другим. Два типа некодирующих РНК участвуют на заключительных этапах белкового синтеза — в процессах трансляции, имеющих место в цитоплазме. Таковы рибосомные РНК (рРНК), комплексирующиеся вместе с белками в рибосомы, и транспортные РНК (тРНК — 70-95 нуклеотидов), участвующие в переносе аминокислот во время синтеза белковой цепи (подробнее см. Мушкамбаров, Кузнецов, 2003; Cooper, 2000). Ядерные РНК (мяРНК — snRNA: 100-300 нуклеотидов у человека) контролируют процессы сплайсинга. Они вместе с ферментами, катализирующими вырезание интронов, формируют особые структуры, называемые сплайосомами. Ядрышковые РНК (мяоРНК- snoRNA: 50-200 нуклеотидов), спариваясь с другими РНК, регулируют изменения последних, в частности 2'-0 метилирование рибозы у рибосом-ных РНК и псевдоуридилирование (замещение уридина на псевдоури-дин) у мяРНК. Некоторые мяоРНК осуществляют процессинг пре-рРНК, разрезая ее на конечные рибосомные компоненты 18S (ок 2000 н.), 5,8S (155 н.) и 28S (ок. 4000 н.). RNase P и RNase MRP РНК, входящие в рибонуклеопротеиновые комплексы являются эндорибонукле-азами, функция которых связана с удалением определенных последовательностей из РНК. Первый из них отрезает у предшественника тРНК его неспаренный в шпильку 5' конец. Аналогичную операцию удаления неспаренного 3' конца осуществляет белок, входящий в данный рибонуклеопротеиновый комплекс. Теломеразная РНК (ок. 450 н.) и связанная с ней в единый теломеразный комплекс обратная транс-криптаза осуществляют удлинение теломер, добавляя к концам эука-риотических хромосом G-богатые теломерные повторы. Некодирующие РНК выполняют и многие другие повседневные внутриклеточные функции. SRP (signal recognition particle) РНК образует рибонуклеопротеиновый комплекс из шести полипептидов и одной молекулы РНК (ок. 300 нуклеотидов), обозначаемой 7SLPHK. Этот комплекс контролирует потоки белков в эндоплазматическом ретикулуме. В последнее время была выявлена большая группа некодирующих РНК, выполняющих регуляторные функции. Среди последних различают малые нкРНК, размеры которых не превышают 200 (по более ранним классификациям 500) нуклеотидов (Costa, 2005; Huttenhofer, Schattner, 2006; Макарова, Крамеров, 2007), и длинные нкРНК. Длинные нкРНК контролируют ДНК-последовательности, соседние с теми, с которых эти РНК транскрибируются. Наиболее изученными среди них являются нкРНК-гены Xist и Tsix, участвующие в инактивации Х-хромосомы (Жимулев, 2003; Лавров, Кибанов, 2007). Считывание мРНК-генов с отцовской Х-хромосомы подавляется экспрессией Xist, в то же время экспрессия Xist на материнской хромосоме X подавляется при участии гена Tsix, имеющего антисмысловую транскрипционную направленность. Мутация в Tsix приводит к экспрессии гена Xist и к инактивации материнской Х-хромосомы. У Drosophila аналогом Xist является нкРНК-ген гоХ, выступающий в качестве ключевого элемента в дозовой компенсации Х-хромосомы (Жимулев, 2003; Лавров, Кибанов, 2007; Bal et al, 2007).
Геномный импринтинг
Рассмотрим подробнее работу нкРНК на примере процессов импринтинга ряда мышиных генов. Большинство генов экспрессируется с обеих гомологичных хромосом (биаллельная экспрессия). Некоторые гены, однако, считываются с какой-то одной хромосомы, попадающей в зиготу либо от отца, либо от матери. В этом случае говорят о моноаллельной экспрессии. Такие гены, очевидно, различаются по своему функциональному состоянию, и это должно находить выражение в их специфическом изменении, свидетельствующем либо об их отцовском происхождении, либо материнском (Сапиенца, 1990; Паткин, Сучкова, 2006). Соответствующие гены называют импринтированными (т. е. несущими отпечаток, молекулярный импринт). Молекулярное мечение генов обычно связано с метилированием ДНК, реже гистонов и этот процесс называют импринтингом. У мыши выявлено около 80 генов, подвергающихся импринтингу. Реальное их число безусловно больше, по некоторым оценкам может исчисляться несколькими сотнями; указывался, в частности, верхний порог в 600 генов (Wood, Oakey, 2006). Импринтиро-ванные гены обычно собраны в кластеры по 3-15 генов, из которых по меньшей мере один кодирует нкРНК, остальные — белок (Pauler, Barlow, 2006; Pauler et al., 2007). Последовательности внутри гомологичных кластеров, различающиеся по метилированию, называют дифференциально метилируемыми доменами (или районами) — Differentially methylated domains (regions), DMD или DMR. Внутри DMD выделяют цисдействующую последовательность, через которую запускаются процессы импринтинга. Эту последовательность называют импринтинг-контролирующим элементом (ICE — Imprinting Control Element) или центром импринтинга. Примерно половина импринтированных генов мыши расположены в седьмой хромосоме, в которой они сгруппированы в пять кластеров (Wood, Oakey, 2006). На рисунке гены, считываемые с материнской хромосомы, записаны слева; гены, считываемые с отцовской хромосомы, изображены с правой стороны. Гены некодирующих РНК заключены в рамку. Отметим одну важную особенность импринтированных генов. При метилировании ICE имеет место экспрессия белок-кодирующих генов и репрессия связанной с этим комплексом нкРНК, которая однако экспрессируется с гомологичной хромосомы (материнской или отцовской). В неметилированных ICE имеет место обратное соотношение (Pauler, Barlow, 2006). Например, кластер Kcnql содержит девять генов, кодирующих мРНК, которые лежат по обе стороны от гена Kcnql otl (£c/j#/overlapping transcript 1), кодирующего нкРНК. Последний ген считывается с отцовской хромосомы. Его промотор, включающий ICE-последовательность, расположен в десятом интроне гена Kcnql, но имеет антисмысловую ориентацию. Экспрессия гена Kcnql otl необходима для глушения всех соседних девяти мРНК-генов, образующих по данной особенности функциональный кластер. Кластер назван по гену Kcnql, который кодирует калиевый трансмембранный канал подсемейства KQT—Potassium voltage-gated channel KQT-like subfamily 1. Таким образом, с отцовской хромосомы ген Kcnqlotl считывается, а связанные с ним гены молчат. Напротив, в материнской хромосоме ген Kcnqlotl метилирован и не транскрибируется. Как результат, он не репрессирует соседние с ним гены, и они считываются (Pauler, Barlow, 2006; Pauler et al., 2007; Mohammad, 2008; Pandey et al., 2008; Wu, Bernstein, 2008). В рассматриваемом кластере седьмой хромосомы мыши все гены имеют моноаллельную экспрессию. В геноме человека соответствующий кластер расположен в хромосоме 11. Этот кластер отличается от мышиного тем, что внутри него находится ген Phemx с биаллельной экспрессией. Остальные гены имеют моноаллельную экспрессию. Сходные отношения имеют место и в другом важном кластере Ig/2. Есть, правда, существенные различия. Ген Ig/2 (Insulin-like growth factor) считывается с отцовской хромосомы и кодирует инсулин-подобный фактор роста, который активен в мезодермальных и энтодер-мальных тканях в период эмбрионального развития (Паткин, Сучкова, 2006; Delaval et al., 2006; Ридли, 2008). Этот ген имеет альтернативные промоторы (Р0, Р,, Р2, Р3). Р0-/§/2-транскрипты считываются в трофобластах лабиринта плаценты и регулируют плацентарный рост. Соответственно экспрессия Igf2 на отцовской хромосоме стимулирует поступление питательных веществ в плод, тогда как гены Ipl и p57Kip2 ограничивают питание эмбриона (Isles, Holland, 2005). У человека избыточная экспрессия гена IGF2, расположенного в хромосоме 11, ведет к синдрому Беквита-Видемана, сопровождающемуся переразвитием сердца и печени (Ридли, 2008). Другой ключевой ген кластера HI 9 (Hepatic cDNA clone 19) расположен ниже reHa/g/2, а также второго гена кластера /ns2(Insulin2) и кодирует нкРНК. ICR-область, регулирующая активность гена HI 9, расположена вне этого гена, между ним и генами Ig/2 и Ins2. Ген Н19 считывается с материнской хромосомы и подавляет все связанные с ним белок-кодирующие гены кластера. В отцовской хромосоме ICR-область гиперметилируется во время сперматогенеза, что ведет к инактивации промотора гена HI 9 и, как результат, транскрипционной активности генов Ig/2 и Ins2. В материнской хромосоме DMD-область гипометилирована. Поэтому активен промотор гена HI9, а сам ген транскрибируется. Одновременно гипометилированная DMD-область функционирует как инсу-латор, который взаимодействует с СССТС-связывающим фактором (CTCF). Как результат, блокируется связь промоторов генов Igf2 и Ins2, что ведет к их транскрипционной инактивации.
Поскольку инактивация гена Н19 связана с метилированием ICR-области, то недостаток метальных групп способен снизить транскрипционную активность гена Ig/2 у эмбриона, что должно иметь негативные последствия у взрослого человека. Этот вывод нашел подтверждение в результатах обследования голландских граждан, зачатых в последний год второй мировой войны, когда беременные женщины голодали. У родившихся детей была снижена активность Ig/2, что привело к увеличению у них по достижении взрослого состояния частоты онкологических заболеваний, прежде всего рака толстой и прямой кишки. ICR-область с межгенной локализацией отличает и другие мРНК-гены, импринтируемые по отцовской линии (импринтинг устанавливается в сперматозоиде). Таковы гены Dlk (Delta-like l homologue), действующий в связке с геном нкРНК Gtl, и Rasgrfl, взаимодействующий с геном нкРНК А19 (Delaval et al., 2006; Wood, Oakey, 2006). Импринтированное состояние может различаться у гомологичных генов мыши и человека. Хорошо изученным примером является кластер Igf2r (Tg/2-рецептор), расположенный в хромосоме 17 мыши и включающий еще два мРНК-гена — Slc22a2 и Slc22a3, кодиру-ющих транспортеры органических катионов (Morison et al., 2005; Pauler et al., 2007). Эти гены показывают материнскую экспрессию. Регуля-торную функцию выполняет нкРНКЛ/г, считываемая с отцовской хромосомы. Промотор Л//--гена расположен в интроне Igf2r и показывает антисмысловую ориентацию. Транскрипт этого гена частично пересекается с Igf2r транскриптом. В этом отношении Air показывает сходство с Kcnqlotl. Оба гена способны к цис-глушению входящих в соответствующие кластеры мРНК-генов. У человека гены IGF2R и SLC22A2-3 расположены в хромосоме 6. Первый из этих генов кодирует рецептор для устранения избытка IGF2 белка, который, соединяясь с рецептором, подвергается распаду. Существенно, что AIR-тея в геноме человека не выявлен. Таким образом, в отличие от мыши, гены IGF2R и SLC22A2-3 имеют биаллельную экспрессию, установившуюся в качестве реверсии (возврата к исходному состоянию, характерному для птиц и однопроходных) у представителей Euarchonta (тупайи, лемуры, обезьяны и человек) (Vu et al., 2006). У млекопитающих импринтированные гены участвуют в процессах эмбрионального развития. Причем материнские гены действуют на него негативно, замедляя, например, рост, тогда как отцовские гены, наоборот, ускоряют развитие. Если мы возьмем гены Ig/2 и Ig/2r> продукты которых взаимодействуют в период эмбрионального развития, то уменьшение экспрессии первого из этих генов (отцовского) ведет к ограничению внутриматочного роста. Уменьшение экспрессии второго (материнского) гена имеет обратный эффект (Isles, Holland, 2005). Отметим одну важную особенность импринтированных генов. При метилировании ICE имеет место экспрессия белок-кодирующих генов и репрессия нкРНК и наоборот (Pauler, Barlow, 2006).
Малые некодирующие РНК
Малые РНК могут быть сгруппированы по размеру, структуре, ключевым мотивам, функции и ряду других признаков. Особая роль в процессах регуляции принадлежит двум типам малых некодирующих РНК: микроРНК (miRNA) и интерферирующим РНК (миРНК — siPHK). Оба типа, включающие от 20 до 28 нуклеоти-дов, различаются по генезису (Bartel, 2004; Омельянчук и др., 2005; Axtell, Bartel, 2005; Kim, 2005 a,b; Chopra, Mishra, 2006). siPHK (21-28 нуклеотидов) образуются из длинных двуцепочечных РНК, расщепляемых на короткие отрезки РНКазой III, называемой Dicer. Они могут появляться в клетке экзогенно, как ответная реакция на внедрение в клетку вирусных РНК, которые разрезаются на двунитевые фрагменты, и эндогенно для обеспечения собственных регуляторных процессов (Mathieu, Bender, 2004). Эндогенные siPHK делят на три подкласса (Kim, 2005b): (1) транс-действующие siPHK (tasiPHK — 21-22 нуклеотида), кодируемые у растений из межгенных участков; (2) ассоциированные с повторами молекулы (rasiPHK — 24-27 нуклеотидов) и (3) сканирующие siPHK (scnPHK: 28 нуклеотидов), участвующие в перестройках ДНК и известные у Tetrahymena thermophila. Эндогенные двуцепочечные siPHK образуются в результате встречной экспрессии комплементарных нитей ДНК, отвечающих соответствующему «гену». Образующиеся транскрипты от сестринских последовательностей ДНК процессируются до двуцепочечных предположительно с помощью РНК-зависимой РНК-полимеразы. tasiPHK известны у растений и нематоды Caenorhabditis elegans; у насекомых и позвоночных не найдены. У дрожжей rasiPHK могут подавлять транскрипцию повторных подвижных элементов. Предшественник scnPHK через встречную экспрессию синтезируется в микронуклеусе. После расщепления Dicer-подобной РНКазой и образования scnPHK последние диффундируют в материнский макронуклеус, переходя далее в дочерний макронуклеус, в котором они включаются в комплекс RITS (RNA-induced initiation of transcriptional gene silencing). Этот комплекс участвует в метилировании гистонов — условие, необходимое для элиминации ДНК в макронуклеусе цилиат. В других случаях siPHK через РНК-связываю-щий фактор Argonaute комплексируется с многокомпонентной эндонук-леазой RISC. Комплекс часто включает РНК-зависимую РНК-полиме-разу, которая синтезирует двуцепочечные dsPHK по одноцепочечным (ssPHK). Клеточная функция комплекса связана с разрушением гомологичных РНК в цитоплазме и нацелена на освобождение клетки от чужеродных, главным образом, вирусных РНК, а также поврежденных транс-криптов и транскриптов, в которых клетка более не нуждается. МикроРНК образуются из транскриптов, т.е. однонитевых мРНК-предшественников (70-200 нуклеотидов длиной), кодируемых неканоническими «генами». В дуплексе микроРНК частично спарена с нитью, обозначаемой микроРНК. Далее микроРНК комплексиру-ется с многокомпонентной эндонуклеазой RISC (RNA induced silencing complex), включающей наряду с Dicer и TRBP, РНК-связывающий фактор Argonaute. Комплекс часто включает РНК-зависимую РНК-по-лимеразу, которая синтезирует двунитевые dsPHK по однонитевым (ssPHK). РНК-субъединицы в этом комплексе могут взаимодействовать с комплементарной последовательность матричной РНК, обычно не превышающей шести-восьми нуклеотидов. При эндонуклеаз-ной активности соответствующего каталитического комплекса RISC этот последний либо расщепляет мРНК, либо подавляет трансляцию. У растений механизм работы микроРНК при разделении матричной РНК аналогичен таковому siPHK. Напротив, у млекопитающих микроРНК связывается с З'-нетранслируемым участком (см. Mignone et al., 2002; Мушкамбаров, Кузнецов, 2003) матричной РНК, закрывая доступ последней к активным сайтам рибосом. Кроме этих двух классов существуют еще несколько слабо изученных малых РНК (Kuwabara et al., 2004; Kim, 2005b): сверхмалые (tiny non-coding — tncPHK: 20 нуклеотидов) и малые модулярные (smPHK: 20 нуклеотидов). синтезируются во всех типах В последние годы выявлена ключевая роль еще одного класса малых РНК, так называемых пиРНК (piRNA) (Ют, 2006; O'Donnell, Boeke, 2007). Они длиннее микроРНК и в этом отношении более близки к rasiPHK. Большинство из них сконцентрировано в ограниченных по длине локусах и транскрибируется с какой-то одной нити ДНК. 17% пиРНК млекопитающих связаны с повторяющимися последовательностями. В клетке малые РНК выполняют разнообразные функции, спектр которых, последовательность выполнения и характер взаимодействия меняются в зависимости от внешних и внутренних сигналов. Их важнейшая регуляторная функция связана с ферментативным разрушением или инактивацией транскриптов и других подлежащих уничтожению РНК-молекул, о чем уже было сказано. Наряду с этим у эукариот нетранслируемые РНК, включая и большие, кодируемые, например, геном Xist (Жимулев, 2003), являются важнейшим инструментом эпигенетического изменения ДНК и гистонов хроматина (Bernstein, Allis, 2005). Так, сРНК, комплексированные с метилтрансферазами, участвуют в метилировании ДНК (Mathieu, Bender, 2004) и в модификации гистонов (у растений и грибов), причем эти изменения при определенных обстоятельствах могут передаваться мейотически (Richards, 2006). Метилирование ДНК осуществляется через dsPHK-зависимый ДНК-метилирующий комплекс памяти (dsRNA-dependent DNA methy-lation complex). siPHK, связанные с этим и другими системами клеточной памяти могут запускать de novo процесс метилирования гомологичных последовательностей ДНК (Mathieu, Bender, 2004; Matzke, Birchler, 2005). Причем цитозин может метилироваться во всех сочетаниях, не только в виде CpG-динуклеотида. При метилировании гистонов (обычно лизина 9 гистона НЗ) (Matzke, Birchler, 2005) siPHK соединяется с Argonaute, но внутри другого белкового комплекса RITS, заякоренного на хроматине с помощью хромодоменного белка Chpl (Grewal, Rice, 2004). Это один из ключевых процессов образования гетерохро-матина. Перемещение малых РНК от источника в другие клетки может и в них вызывать глушение соответствующих генов (Pal, Hurst, 2004). Это показано для растений, у которых малые РНК с помощью специальных белков способны распространяться через сосудистую систему (Yoo et al., 2004), а из животных — для нематоды С. elegans. МикроРНК известны лишь у многоклеточных организмов и регулируют многие ключевые биологические процессы, включая клеточный рост, пролиферацию клеток, их апоптоз, развитие и дифференциацию, поддержание дифференцированного состояния клеточных линий. Дисфункция даже одной микроРНК может вызвать рак у мыши (Costinean et al., 2006). Снижение уровня miR-15a и miR-16-l коррелирует с развитием хронической лимфоцитарной лейкемии. Недифференцированные клетки, в которых инактивирована РНКаза Dicer, хотя и живут, но не способны к дифференциации (Negrini et al., 2007). У позвоночных 80% высококонсервативных микроРНК оказались тка-неспецифичными. Специфичные микроРНК выделены у млекопитающих из сердца (miR-1), печени (miR-122), из гранулоцитов и макрофагов (miR-223) клеток мозга и других органов (Battel, 2004). По существу, каждый клеточный тип на каждой стадии развития животных имеет свой профиль экспрессии микроРНК. Для клеточных типов характерна высокая плотность специфических микроРНК. Например, у взрослой нематоды С. elegans miR-2, miR-52 и другие микроРНК представлены в среднем более 50 тысячами молекул на клетку; реже микроРНК показывают низкую плотность, как например, miR-124, среднее содержание которой составляет всего лишь 800 молекул на клетку.
В качестве генетического регулятора микроРНК функционирует как главный посттранскрипционный репрессор. У млекопитающих выявлено чуть больше 300 микроРНК (Landgraf et al., 2007), мишенями которых, как показывает компьютерный анализ, являются тысячи генов (одна треть всех генов человека). Одна микроРНК может иметь от 100 до 200 разных мРНК в качестве мишеней.
Малые РНК как независимые регуляторы клеточной жизни
Малые РНК обеспечивают второй уровень регуляции экспрессии ДНК. Первый, имеющийся и у прокариот обеспечивается регуля-торными белками.
Одним из механизмов этой регуляции является ферментативное разрушение транскриптов и других подлежащих уничтожению РНК-молекул. Роль малых РНК сводится к мечению последних через гомологичное спаривание. Для этого они комплексируются с белками, включающими ферменты и связывающие белки. Например, клеточная функция миРНК, связанная с разрушением гомологичных РНК в цитоплазме, нацелена на освобождение клетки от чужеродных, главным образом, вирусных РНК, а также поврежденных транскриптов. У животных имеет место механическое глушение мРНК без ее разрыва (Sontheimer, Carthew, 2005). Напротив, у растений при нахождении, например вирусной РНК, имеющей фрагмент, гомологичный с siPHK, эндонуклеаза RISC делает разрыв вирусной РНК в середине гомологичной последовательности. Этот процесс называют РНК-ин-терференциией (RNA interference — RNAi). В ряде исследований (Battel, 2004; Taatjes et al., 2004; Pasquinelli et al., 2005) было показано, что малые РНК у многоклеточных организмов контролируют временную последовательность транскрипционных событий и упорядоченность последних в пространстве. Первая выявленная у нематоды С. elegans микроРНК (lin-4) оказалась переключателем развития (отсюда название этой и других подобных РНК как stPHK — small temporal). Связываясь с З'-нетранслируемым участком, она инактивирует мРНК гена Нп-14 при переходе от первой ко второй стадии личиночного развития (Lim et al., 2003). Примером пространственных переключателей могут служить у той же нематоды miR-273 и Isy-б, являющиеся трансляционными репрессорами ключевых транскрипционных факторов в нейронах, расположенных с правой и левой сторон (Johnston, Hobert, 2003). Соответствующие закономерности были выявлены и для других животных, в последующем также и для растений (Aukerman, Sakai, 2003). Из других функций некодирующих малых РНК отметим их участие в редактировании РНК, а также ДНК (используя обратную транскрипцию) и их способность связывать белки и перемещать последние в нужное место (Brosius, 2005). Малые РНК могут использоваться в качестве платформы, связывающей функциональные белки. Упомянем SRP РНК-частицу, которая одновременно является кофактором каталитической активности удерживаемых ею белков. Эти и другие функции некодирующих РНК определяют возможность контроля основных клеточных процессов, связанных с ростом, делением, дифференциацией и регулируемой смертью (апоптозом) клеток. Например, микроРНК образуют в клетке разветвленную регуляторную сеть, в которой некоторые молекулы в состоянии взаимодействовать с сотнями матричных РНК. В то же время одна матричная РНК может зависеть от многих микроРНК (Hornstein, Shomron, 2006). У растений и животных инактивация Dicer или Argonaute ведет к остановке развития и гибели эмбрионов (Pasquinelli et al., 2005). С другой стороны известны примеры, когда инактивация микроРНК-генов не имеет катастрофических последствий. Отсюда возникло мнение, что малые РНК обеспечивают тонкую настройку работы транскрипционных сетей. Не отрицая этого, все же следует не сбрасывать со счетов еще одну возможность: отмечаемая в ряде примерах нечувствительность транскрипционных сетей (Lai, 2005) может быть связана с участием в их работе большого числа малых РНК, что и позволяет компенсировать частичную потерю транскрипционной активности. Сочетание некодирующих РНК, характерных для разных типов клеток, было предложено называть риботипами (Herbert, 2004). Риботипы отличаются спецификой (профилем) выполняемых им функций. Как-системы регуляции они способны к репликации и поэтому составляют еще один источник наследственности наряду с каноническими генами.Для чего необходима вторая регуляторная система, основанная на малых РНК (риботипах), в дополнение к регуляторным механизмам через систему транскрипционных факторов и сигнальных молекул? Этот вопрос обсуждался многими авторами. Здесь мы остановимся на позиции Маттика (Mattick, 2004; Маттик, 2005; Mattick, Makunin, 2006). Теоретический и предметный анализ регулируемых систем в разных областях науки показал, что при усложнении объекта информационное обеспечение регуляторного (управляющего) контура должно расти нелинейно и часто выражается почти квадратичной зависимостью. Если на каком-то этапе эволюции организмы еще и могли существовать за счет совершенствования авторегуляции в генных (транскрипционных) сетях, то по достижении некоторого уровня сложности возможность дальнейшего прогресса требовала создания принципиально новой автономной регуляторной системы, действующей на независимой материальной основе. Маттик, ссылаясь на математические расчеты, считает, что переход от прокариот к эукариотам как раз и был связан с качественным изменением уровня организационной сложности. Эукариоты, следовательно, и являются объектом приложимости новой концепции наследственности. У многоклеточных животных на работу внутриклеточной транскрипционной сети накладываются регуляторные процессы, связанные, во-первых, с дифференциацией клеточных типов по мере роста клеточной массы, а, во-вторых, с регуляцией пространственно-временных отношений, определяющих последовательность развертывания транскрипционной сети. Иными словами, транскрипционная динамика у эукариот оркестрируется необычайно сложной системой ре-гуляторных некодирующих РНК, которые составляют более 90% от суммарного транскрипционного выхода генома человека. О том, что РНК может быть независимым от ДНК носителем наследственности показано в недавних опытах на линии мышей, мутантных по гену Kit. Этот ген кодирует цитокиновый Kit-рецептор с про-теинтирозин-киназной активностью. Kit-рецептор является ключевым элементом в процессах дифференциации зародыша, кроветворения и меланизации . TmlAlf-мутацш (Kit TmlAlf, первоначально как KitW-LacZ), при которой синтез Kit-рецептора невозможен, вызывает у гомозигот смерть сразу после рождения. Гетерозиготы выживают, но имеют особенный фенотип, отличающийся белым кончиком хвоста и белыми лапами. В потомстве от скрещивания гетерозигот (Kit+А) между собой, а также с нормальными особями (KU+/+) большинство особей имело белый хвост и белые лапы. Существенно, что этот фенотип проявился и у генетически нормальных (KU+/+) потомков. В то же время не отмечалось гибели гомозиготных потомков (Rassoulzadegan et al., 2006). Налицо нарушение менделевских законов. Далее было показано, что инъекция РНК, полученной из Kit TmlAlf гетерозигот, в одноклеточный эмбрион, нормальный по Kit-тещ, ведет к мутантному фенотипу. Оказалось, что и сперма может передавать через РНК функциональную информацию. Это означает, что РНК независимо от ДНК может передавать наследственную информацию в ряду поколений. Механизмы такой передачи не совсем ясны. Предполагают, что процесс размножения испорченной РНК осуществляется по типу воспроизведения прионов: испорченные РНК «портят» новые РНК, транскрибируемые немутантным аллелем Kit. Во всяком случае через этот механизм происходит сохранение специфической РНК при формировании долговременной памяти.
