Опухолевые супрессоры
Онкогены при нарушениях регуляторных механизмов способны индуцировать избыточный рост, который может приводить к раку. Белковые продукты, кодируемые генами опухолевых супрессоров, напротив, подавляют рост и размножение клеток. Список этих генов дан в таблице 9.3. В ряде случаев про-тоонкогены и опухолевые супрессоры показывают прямую связь между собой, действуя на одни и те же или сопряженные сигнальные каскады, но в противоположных направлениях. Ввиду этого опухолевые супрессоры называют антионкогенами. TGF-p/Smad-сигнальный путь играет большую роль в процессах апоптоза и выживаемости клеток (Downing, 2004; Conery, Luo, 2006), нарушение которых сопряжено с развитием различных форм рака (Kim, Letterio, 2006; Bruna et al., 2007). Трансформирующий фактор роста бета (Transforming growth factor-beta, TGF-(3) является цито-кином и функционирует как опухолевый супрессор (Grady, 2005), действуя через трансмембранный гетеромерный комплекс T$RII (TGF-beta receptor type И) и TPRI. Члены семейства выделены у губок, нематод, насекомых, иглокожих и позвоночных (Massague et al, 2005). Они играют большую роль в раннем развитии при образовании осей, а также в органогенезе (Шаталкин, 2003). Наиболее известным лигандом, действующим через эти рецепторы, является белок decapen-taplegic (dpp). Его гомологами у позвоночных являются ВМР2/ВМР4 (Bone morphogenic protein). BMP-сигнальный путь, значимый для некоторых форм рака, далее не рассматривается. Рецептор второго типа (TbRII) является первым компонентом, с которым связывается лиганд TGF-3. Далее активированный рецептор II должен соединиться и фосфорилировать рецептор первого типа, который в свою очередь фосфорилирует и, следовательно, изменяет конформа-цию цитоплазменного белка Smad. Белки семейства Smad человека гомологичны белкам SMA нематоды С. elegans и MAD (mothers against decapentaplegic) дрозофилы (Massague et al, 2005; Kim, Letterio, 2006). От соединения двух последних названий образовано первое. Кодируют белки Smad гены DPC и MADR2. Оба являются опухолевыми супрессорами. Мутации в первом гене связаны с раком иод-желудочной железы, мутации во втором — с колоректальиым раком. Комплекс Smad2/3 в неактивном состоянии сцеплен с якорным цитоплазматическим белком SARA (Smad anchor for receptor activation), от которого отсоединяется в результате фосфорилирования, переходя из цитоплазмы в ядро. В ядре Smad2/3 комплексируется с Smad4. Комплекс Smad2/3/4 имеет двоякую судьбу. Соединяясь с двумя другими белками E2F4/5 и р107, они формируют репрессирующий фактор, действующий на промотор гена с-Мус, снижая его активность вплоть до полного выключения. Комплекс Smad2/3/4 может также связываться с активирующими белками и функционировать как транскрипционный активатор, индуцирующий экспрессию генов CDKN2B и CDKNIA. Эти гены кодируют ингибиторы клеточного цикла белки р15ШК4Ь (ингибирует циклин-зависимую киназу Cdk4) и р21с,р' (ингибирует Cdk2) и их экспрессия возможна лишь при низком уровне белка с-Мус. При высоком уровне белок с-Мус комплексируется с MIZ-1 и блокирует работу Smad-комплекса, репрессируя тем самым экспрессию генов CDKN2B и CDKNIA. TGF-p/Smad сигнальный путь тормозит через снижение экспрессии протоонкогена с-Мус рост и митотическую активность клетки. Ключевые белки этого пути передают в клетку антимитогенный сигнал и являются, таким образом, опухолевыми супрессорами. Мутации в соответствующих генах и их частичная или полная инактивация будут повышать уровень митогенного сигнала в клетке, исходящего от протоонкогена с-Мус, блокирующего экспрессию ингибиторов цик-лин-зависимых киназ Cdk. Важно отметить, что конечные внутриядерные этапы TGF-fVSmad сигнального пути включают транскрипционные репрессоры E2F4/5 и р107, которые являются ключевыми элементами сигнальных каскадов, связанных с фосфобелком pRb. Наконец, показано, что MAPK(шitogen-activatedgroteinkinase)-cигнaльный путь, в котором сигнал передается с помощью особых митозактивирующих протеинкиназ (МАРК, МАРКК, МАРККК), может активироваться через TGF-бета рецептор и, кроме того, влиять на Smad-белки (Javelaud, Mauviel, 2006). В итоге при прохождении сигналов по этим взаимосвязанным сигнальным путям возможны разного рода интерференционные проявления. Отметим также, что компоненты TGF-/Smad сигнального пути способны влиять на элементы других сигнальных путей. Аденоматозный полипоз толстой кишки. В желудочно-кишечном тракте развитие этой формы рака связано с мутацией гена наследственного аденоматозного полипоза толстой кишки (АПТК — АРС, Adenomatous polyposis coli) (Ottini et al., 2006). Индуцированные мутации в АРС (у мышей) ведут к кишечным аденомам. Семейная (врожденная) форма АПТК связана с инактивацией гена АРС в зародышевой линии. АРС-белок является ключевым элементом Wnt-сигнального пути. Название Wnt является объединением сокращенных названий ортологичных генов wingless (wg) у дрозофилы и шМ (позже Wnt-\) у мыши. Гликозилированные продукты этих генов функционируют как факторы роста, которые взаимодействуют с 7ТМ-рецептора-ми Frizzled/TAS2-ioiacca. Wnt-сигнал может передаваться через разные посредники. Wnt-сигнальный путь, в котором ключевым посредником является Р-катенин, называют каноническим. Он играет большую роль в процессах развития. В частности, у насекомых он имеет ключевое значение в процессах сегментации. Выделяют три типа Wnt-сигнальных путей. Белок Armadillo является ключевым в каноническом Wnt-сигнальном пути. Он принадлежит семейству Р-катенинов (P-cat), отличающихся наличием особых armadillo-повторов, находящихся в центре молекулы (Gottardi, Peifer, 2008; Xing et al., 2008). Через эти повторы, но разные их участки, Р-катенин может соединяться (1) с трансмембранными Е-кадеринами, (2) инактивирующим цитоплазматическим комплексом Adenomatous polyposis coli (АРС — см. Aoki, Taketo, 2007), включающим наряду с АРС, также другие белки, в частности, платформенный белок Axin и киназы Casein kinase I (CKI) и Glycogen synthase kinase-3b (GSK-3b); в ядре 3-катенин способен соединяться (3) с транскрипционными факторами семейства LEF/TCF (Gottardi, Gumbiner, 2001; Clevers, 2006). В сравнении с 3-катенином киназа GSK-ЗЬ показывает большее сродство с АРС и поэтому она вытесняет из комплекса 3-катенин, который захватывается протеосомами и переваривается. Транскрипционные белки LEF/TCF в неактивном состоянии блокированы репрессорами Groucho (Gro) и Carboxy-terminal binding protein (CtBP). В отсутствии Wnt-сигнала (рис. 9.10а) P-cat фосфорилируется ки-назой GSK-3J3 и в этом состоянии подвергается протеосомному разложению (Cadigan, Liu, 2006). Поэтому АРС-комплекс называют часто деградационным. Передача Wnt-сигнал требует участия второго трансмембранного рецептора LRP (LDL receptor-related protein), имеющего лишь одну проходящую через мембрану спираль. При возбуждении лигандом Wnt спаренных рецепторов LRP связывает аксин, а GSK-ЗР фосфорилирует Dishevelled. Как результат, АРС-комплекс не может фосфорилировать Р-катенин. Последний отделяется от комплекса, накапливается в цитозоле и далее попадает в ядро, где в составе своего транскрипционного активатора вытесняет репрессор Groucho (Gro), делая транскрипционный комплекс LEF/TCF активным. Из числа кодируемых генов отметим туспротоонкогены, мутантные формы которых связаны с разными типами рака. Для транскрипционного включения разных генов (3-катенин взаимодействует с многими белками, такими как ТАТА-связывающий белок, CREB-связывающий белок, MED12 и другими (Stadeli et al., 2006). В числе регуляторов транскрипции следует также отметить комплекс, который включает циклин-зависимую киназу 8 (Cdk8), связанную с циклинами С-типа (СусС). У мух этот комплекс действует как супрессор транскрипционного фактора E2F (Morris et al., 2008). Этот фактор включает экспрессию многих генов, в том числе AXIN1, AX1N2 и SIAH1, продукты которых участвуют в деградации катенина. Следовательно, E2F в данном случае будет в конечном итоге подавлять активность транскрипционного комплекса катенин/LEF/TCF Кроме того, E2F в случае семейной формы полипоза толстой кишки находится под негативным контролем фосфобелка pRb. Напомним, что pRb связывает E2F, т.е. по функции является опухолевым супрессором. Мутантные pRb не способны связывать E2F и тем самым ограничивать активность этого транскрипционного фактора. В случае семейной формы полипоза толстой кишки мутантные pRb не отмечены. Более того, наблюдается повышенная экспрессия pRb. Это может свидетельствовать в пользу того, что pRb в данной форме рака функционирует как онкобелок (Bernards, 2008).
Репарационные процессы
Нормальные клетки отвечают на стресс и связанное с ним повреждение ДНК изменением регуляторного контура процессов размножения и апоптоза (индуцированной клеточной смерти), а также включением репарационных механизмов. Имеется два типа повреждений ДНК, восстанавливаемых в одном случае с помощью обратной химической реакции, в другом — удалением поврежденных участков и их заменой новой синтезированной ДНК (Cooper, 2000; Жимулев, 2003). К первым относится, например, фотореактивация. Под действием УФ-излучения соседние пиримидины ДНК, такие как тимин, способны отсоединяться от нуклеотидов комплементарной нити (в случае тимина от аденина) и соединяться между собой в димер с образованием циклобутанового кольца. Солнечный свет дает энергию для обратной реакции (фотореактивации) — разрыва циклобутанового кольца и восстановления связей между пиримидинами и пуринами. Другим химически обратимым повреждением ДНК является ее алкилирование — перенос метиловой или этиловой групп на кислород в шестом положении (О6) пуринового кольца. В случае метилированного гуанина (06-метилгуанина) он не найдет себе пары, поскольку спаривается с тимином (неметилированный гуанин спаривается с цитозином). Известно несколько репарационных систем, специализирующихся на удалении поврежденного участка ДНК (Hoeijmakers. 2001; Brosh, Bohr, 2007). Один механизм связан с вырезанием неспаренного основания, возникшего в результате повреждения, например, дезаминации цитозина и превращения его в урацил (репарация с удалением основания — BER, base-excision repair). Реакция удаления осуществляется с помощью ДНК-гликозилазы, разрывающей связь основания с сахаром. Далее в работу вступают особая АР-эндонуклеаза, опознающая сайт без пурина или пиримидина (apurinic apyridiminic. АР), фосфодиэстераза и ряд других ферментов (Жимулев, 2003). Отметим, что BER-репаросома может вырезать и соседние с поврежденным основания, но общая длина вырезаемого отрезка не превышает шести нуклеотидов. Другой механизм связан с вырезанием последовательности нуклеотидов, включающей и поврежденные основания, большей длины (до 29) — репарация с удалением нуклеотидов (NER, nucleotide-excision repair). У человека выявлено шесть генов XP (A-G) и вспомогательный ген ERCCI, продукты которых образуют NER-репаросому. NER-репаросома включает белки, опознающие повреждение, геликазы и особые нуклеазы, надрезающие ДНК (отступя на несколько нуклео-тидов по обе стороны от поврежденного участка). Мутации в ХР-генах являются причиной пигментной ксеродермы (xeroderma pigmentosum — сверхчувствительность к УФ-облучению, появление красных пятен на коже, коросты) и трихотиодистрофии (сверхчувствительность к УФ-облучению, недостаток серы в волосах, кожные аномалии, физическое и умственное недоразвитие). Ксеродерма способна трансформироваться в рак; случаев рака, связанных с трихотиоди-строфией, не зарегистрировано. Транскрипционный фактор р53 является ключевым в активации NER-репаросомы. При стрессовых повреждениях ДНК он включает экспрессию генов Gadd45 и р48ХРЕ, белковые продукты которых обеспечивают доступ NER-репаросомы к поврежденному сайту. Репарация неспаренных пар оснований ДНК (мисмэтч-репара-ция — mismatch (excision) repair, MMR) представляет третью эксцизи-онную систему (Cooper, 2000; Жимулев, 2003), исправляющую в основном ошибки репликации. У человека мутации в генах этой системы являются причиной наследственного неполипозного рака толстой кишки. Основными являются следующие гены MSH2-3 (mutS homolog 2-3), MLH1-3 (mutL homolog 2-3), PMS1-2 (postmeiotic segregation increased 2), TFGBR2 и др. При устранении двойных разрывов ДНК ключевую роль играют две киназы, относящиеся к фосфатидилинозитЗ-киназам (Kobayashi et al., 2008). Они кодируются генами ATM (Ataxia-Telangiectasia Mutated) и ATR (ATM-RAD3-related). Первое обозначение производно от названия болезни (атаксия-телангиэктазия, или синдром Луи-Бара), возникающей в результате мутации в ATM-гене. Синдром проявляется в нейромоторной дисфункции (атаксия), в расширенных кровеносных сосудах глаз (телангиэктазия), предрасположенности к раковым заболеваниям в раннем возрасте. Киназа ATM показывает активность при устранении двунитевых разрывов ДНК, вызванных главным образом ионизирующей радиацией. Киназа ATR участвует в устранении более широкого спектра повреждений, в том числе возникающих в процессах репликации; она является также сенсором ультрафиолетовых повреждений ДНК. У человека мутации в сплайсинге /177?-гена, приводят к «птицеголовой низкорослое™» — синдрому Секкела (названного по имени педиатра, изучавшего данный синдром: Helmut G.P. Seckel, 1900-1960) (O'Driscoll et al., 2003). Эукариотическая клетка использует два сигнальных каскада для устранения двойных разрывов: (1) негомологичное воссоединение концов (NHEJ, non-homologous end joining) и (2) гомологическую рекомбинацию (Бабынин, 2007; San Filippo et al., 2008). Второй путь может быть подразделен на консервативный механизм генной конверсии и неконсервативный механизм отжига комплементарных цепей ДНК (SSA, single-strand annealing). Последний механизм используется в тех случаях, когда по обеим сторонам разрыва нити ДНК присутствуют прямые повторы (Sugawara et al., 2008; Mansour et al., 2008). Первый шаг связан с отсечением (резекцией) 5' концов между повторами с помощью с экзонуклеазы. Длинные 3' концы обволакиваются репликационным белком A (RPA, replication protein А), который на следующем шаге замещается белком RAD52. RAD52 фиксирует комплементарные отрезки нитей между повторами. Свободные гетерологичные 3' концы в точке вхождения однонитевого хвоста в область двунитевой ДНК удаляются RAD1-RAD10 эндонуклеазой. Концы сшиваются (лигируются). При NHEJ на разорванные концы с обеих сторон бреши «садятся» гетеродимеры Ku70/Ku80, защищающие концы ДНК от распада и служащие платформой для ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PK, DNA-dependent protein kinase). Последние связывают концы ДНК и рекрутируют нуклеазу ARTEMIS, действующую в направлении 5'—>3'. Далее в работу включается ДНК-полимераза ц (или А.) и завершается процесс сшивкой нитей с помощью ДНК-лигазы LigIV/XRCC4 (подробнее см.: Tsukamoto, Ikeda, 1998; Dudasova, 2004). При консервативной гомологичной рекомбинации двойные разрывы опознаются особым репарационным комплексом MRN, кодируемым тремя генами: MRE11 (Meiotic recombination protein-11), RAD50 и NBS1 (Nijmegen breakage syndrome 1). Мутации в последнем гене ведут к ниймегеновскому синдрому (названному по голландскому городу Ниймеген, в котором был зарегистрирован этот синдром). Клиническая картина заболевания включает радиочувствительность, нарушение иммунитета, геномную нестабильность, выливающуюся часто в рак. Мутация в гене RAD50 дает один из вариантов ниймегеновского синдрома. Кодируемый геном белок осуществляет сцепление разорванных концов, которые благодаря этому удерживаются вместе (Czornak et al., 2008; Riches et al., 2008). Наконец, мутации в гене MRE11 являются причиной АТ-подобного расстройства (АТ-like disorder). MRE11 кодирует эндонуклеазу, способную разрывать связи между нуклеотидами. Но она действует только в направлении У—>5'. Два MRN-комплекса садятся на концы нитей ДНК с обеих сторон от бреши, образованной разрывом. В этом состоянии они рекрутируют ATM. Ключевую роль в этом играет NBS1. Комплекс подготавливает 5' концы для деградации, которые затем отрезаются с помощью нуклеаз (Zhu et al., 2008). MRN через NBS1 активирует АТМ-киназу, которая фосфорилиру-ет С-терминальные хвосты гистонов Н2АХ-варианта, непосредственно соседствующих с разрывом. Фосфорилированные пистоны в свою очередь активируют медиатор сверочных точек MDC1 (mediator of DN A damage checkpoint protein-1), который являются амплификатором (умножителем) ATM каскадов. Рекрутируемые дополнительные АТМ-киназы (по другим сценариям дополнительные ATM-MRN комплексы) расширяют область фосфорилирования Н2АХ-гистонов вокруг бреши. В результате изменяется структура хроматина, что в свою очередь способствует накоплению вокруг разорванных концов ДНК ряда белков, являющихся субстратом для киназной активности ATM. У Saccharomyces cerevisiae действует аналогичный MRX-комплекс, в котором третий член Xrs2 является гомологом NBS1 человека. У этих дрожжей к репарации подключаются Sae2, геликаза Sgsl и нук-леазы Exol (Takeda et al., 2007; Mimitou, Symington, 2008). У человека им соответствуют гомологичные белки CtIP, BLM, EXOl и; кроме того, участвует нуклеаза Dna2 (Zhu et al., 2008). BLM-геликаза (член RecQ-семейства) индуцирует нуклеолитическую активность hExol, действующую в направлении 5'—>3', и отсечение (резекцию) 5'-концов разорванных ДНК. В итоге образуются У ОН однонитевые свободные хвосты. Эти хвосты являются мишенями рекомбиназ Rad51, которые образуют вокруг хвоста нуклеопротеиновый филамент (Nimonkar et al., 2008). Связанные с Rad51 однонитевые хвосты способны спариваться со сходными нуклеотидными последовательностями гомологичной хромосомы (образование D-петли) и достраиваться, выполняя функцию праймеров в репарационном синтезе ДНК. Образование Rad51 -филаментов и формирование D-петель регулируется также BRCA2 (Boulton, 2006). Потеря этих регуляторных функций в результате мутации гена BRCA2 ведет к раку молочной железы (см. дальше). Отмечено также взаимодействие BRCA1 с Rad51, но оно не является прямым. На заключительном этапе достроенные нити сшиваются ДНК-лигазами. Важную роль в механизмах репарации играют процессы убикви-тинирования. Ube 13 необходим для сборки нуклеопротеинового фи-ламента. Одним из субстратов Ube 13 является Н2АХ; полиубиквити-нирование этого варианта гистона изменяет хроматиновую структуру вокруг разрыва. Другим катализатором убиквитинирования хроматина выступают белки, связанные с анемией Фанкони (FA, Fanconi anemia). Это заболевание характеризуется деформацией пальцев и другими скелетными нарушениями, связанными с костно-мозговыми процессами, дополнительно возникают урогенитальные, сердечные, желудочно-кишечные нарушения, геномная нестабильность увеличивает вероятность возникновение рака (Wang, 2007). Гены, мутации в которых вызывают анемию Фанкони, кодируют FancA/B/C/E/F/G/L/M, FancD2, рекомбиназу BRCA2/FancDl, комплексирующуюся с Rad51 и Dssl, PALB2/FancN в качестве партнера BRCA2, 5'—3' геликазу BRIPI/FancJ, зависимую от BRCA1. FA-комплекс активируется ATR-киназой. BRCA1-зависимому убиквитинированию подвергается CtlP. ак было сказано, киназа ATR имеет более широкий спектр активности и, в частности, контролирует процессы восстановления одно-ниточных разрывов, включая разрывы, сопровождающие процессы репликации. Такие разрывы обнаруживаются репликационным белком A (RPA, replication protein А), который комплексируется вокруг разрыва (Shiotani, Zou, 2009). С этим белком соединяется регулятор-ный белок ATRIP (ATR-interacting protein), который в свою очередь комплексируется с ATR. Наряду с комплексом RPA/ATRIP/ ATR процесс репарации требует участия ряда других белков, из которых ключевыми являются RAD17 и кольцевой тримерный комплекс, образованный белками RAD9-RAD1-HUS1 (и обозначаемый также как 9-1-1). RAD17 рекрутирует комплекс 9-1-1 к поврежденному сайту, но его рекрутирующая активность зависит от RPA. Киназная активность ATR на поврежденном сайте определяется ТорВР 1 (Topoisomerase (DNA) II binding protein 1) — белком, связывающим топоизомеразу II. В свою очередь ATR и ATM могут фосфорилировать (активировать) ТорВР 1 (Burrows, Elledge, 2008). Активация ATR при устранении двойных разрывов ДНК зависит от ATM (Kobayashi et al., 2008). Оба сенсора, как ATM, так и ATR, фосфорилируют при разрывах ДНК также BRCA1. Гены BRCA1 и BRCA2 ассоциированы с раком молочной железы. Это заболевание существует в двух формах, семейной (наследственной), передаваемой в поколениях, и спорадической, поражающей с возрастом лишь данную конкретную женщину. Первая связана с мутациями в BRCA1. У 85% женщин, унаследовавших му-тантный BRCAl-аллелъ, развивается рак (Клаг, Каммингс, 2007). В отличие от спорадического семейный рак протекает более тяжело и сопровождается высоким митотическим индексом, мутациями в р53 (70-80%), резким снижением экспрессии рецепторов для эстрогена и прогестерона (Hartman, Ford, 2003). Спорадическая форма часто вызывается мутациями в генах erbB-2, с-тус и некоторых других. Эта форма рака молочной железы не всегда сопровождается мутациями в Я7?С4-генах. Их инактивация в этом случае может осуществляться через процессы метилирования. Из 120 генов, участвующих в восстановлении поврежденной ДНК, мутации лишь в небольшой их части приводят к раковым заболеваниям у человека.
Онкогены при нарушениях регуляторных механизмов способны индуцировать избыточный рост, который может приводить к раку. Белковые продукты, кодируемые генами опухолевых супрессоров, напротив, подавляют рост и размножение клеток. Список этих генов дан в таблице 9.3. В ряде случаев про-тоонкогены и опухолевые супрессоры показывают прямую связь между собой, действуя на одни и те же или сопряженные сигнальные каскады, но в противоположных направлениях. Ввиду этого опухолевые супрессоры называют антионкогенами. TGF-p/Smad-сигнальный путь играет большую роль в процессах апоптоза и выживаемости клеток (Downing, 2004; Conery, Luo, 2006), нарушение которых сопряжено с развитием различных форм рака (Kim, Letterio, 2006; Bruna et al., 2007). Трансформирующий фактор роста бета (Transforming growth factor-beta, TGF-(3) является цито-кином и функционирует как опухолевый супрессор (Grady, 2005), действуя через трансмембранный гетеромерный комплекс T$RII (TGF-beta receptor type И) и TPRI. Члены семейства выделены у губок, нематод, насекомых, иглокожих и позвоночных (Massague et al, 2005). Они играют большую роль в раннем развитии при образовании осей, а также в органогенезе (Шаталкин, 2003). Наиболее известным лигандом, действующим через эти рецепторы, является белок decapen-taplegic (dpp). Его гомологами у позвоночных являются ВМР2/ВМР4 (Bone morphogenic protein). BMP-сигнальный путь, значимый для некоторых форм рака, далее не рассматривается. Рецептор второго типа (TbRII) является первым компонентом, с которым связывается лиганд TGF-3. Далее активированный рецептор II должен соединиться и фосфорилировать рецептор первого типа, который в свою очередь фосфорилирует и, следовательно, изменяет конформа-цию цитоплазменного белка Smad. Белки семейства Smad человека гомологичны белкам SMA нематоды С. elegans и MAD (mothers against decapentaplegic) дрозофилы (Massague et al, 2005; Kim, Letterio, 2006). От соединения двух последних названий образовано первое. Кодируют белки Smad гены DPC и MADR2. Оба являются опухолевыми супрессорами. Мутации в первом гене связаны с раком иод-желудочной железы, мутации во втором — с колоректальиым раком. Комплекс Smad2/3 в неактивном состоянии сцеплен с якорным цитоплазматическим белком SARA (Smad anchor for receptor activation), от которого отсоединяется в результате фосфорилирования, переходя из цитоплазмы в ядро. В ядре Smad2/3 комплексируется с Smad4. Комплекс Smad2/3/4 имеет двоякую судьбу. Соединяясь с двумя другими белками E2F4/5 и р107, они формируют репрессирующий фактор, действующий на промотор гена с-Мус, снижая его активность вплоть до полного выключения. Комплекс Smad2/3/4 может также связываться с активирующими белками и функционировать как транскрипционный активатор, индуцирующий экспрессию генов CDKN2B и CDKNIA. Эти гены кодируют ингибиторы клеточного цикла белки р15ШК4Ь (ингибирует циклин-зависимую киназу Cdk4) и р21с,р' (ингибирует Cdk2) и их экспрессия возможна лишь при низком уровне белка с-Мус. При высоком уровне белок с-Мус комплексируется с MIZ-1 и блокирует работу Smad-комплекса, репрессируя тем самым экспрессию генов CDKN2B и CDKNIA. TGF-p/Smad сигнальный путь тормозит через снижение экспрессии протоонкогена с-Мус рост и митотическую активность клетки. Ключевые белки этого пути передают в клетку антимитогенный сигнал и являются, таким образом, опухолевыми супрессорами. Мутации в соответствующих генах и их частичная или полная инактивация будут повышать уровень митогенного сигнала в клетке, исходящего от протоонкогена с-Мус, блокирующего экспрессию ингибиторов цик-лин-зависимых киназ Cdk. Важно отметить, что конечные внутриядерные этапы TGF-fVSmad сигнального пути включают транскрипционные репрессоры E2F4/5 и р107, которые являются ключевыми элементами сигнальных каскадов, связанных с фосфобелком pRb. Наконец, показано, что MAPK(шitogen-activatedgroteinkinase)-cигнaльный путь, в котором сигнал передается с помощью особых митозактивирующих протеинкиназ (МАРК, МАРКК, МАРККК), может активироваться через TGF-бета рецептор и, кроме того, влиять на Smad-белки (Javelaud, Mauviel, 2006). В итоге при прохождении сигналов по этим взаимосвязанным сигнальным путям возможны разного рода интерференционные проявления. Отметим также, что компоненты TGF-/Smad сигнального пути способны влиять на элементы других сигнальных путей. Аденоматозный полипоз толстой кишки. В желудочно-кишечном тракте развитие этой формы рака связано с мутацией гена наследственного аденоматозного полипоза толстой кишки (АПТК — АРС, Adenomatous polyposis coli) (Ottini et al., 2006). Индуцированные мутации в АРС (у мышей) ведут к кишечным аденомам. Семейная (врожденная) форма АПТК связана с инактивацией гена АРС в зародышевой линии. АРС-белок является ключевым элементом Wnt-сигнального пути. Название Wnt является объединением сокращенных названий ортологичных генов wingless (wg) у дрозофилы и шМ (позже Wnt-\) у мыши. Гликозилированные продукты этих генов функционируют как факторы роста, которые взаимодействуют с 7ТМ-рецептора-ми Frizzled/TAS2-ioiacca. Wnt-сигнал может передаваться через разные посредники. Wnt-сигнальный путь, в котором ключевым посредником является Р-катенин, называют каноническим. Он играет большую роль в процессах развития. В частности, у насекомых он имеет ключевое значение в процессах сегментации. Выделяют три типа Wnt-сигнальных путей. Белок Armadillo является ключевым в каноническом Wnt-сигнальном пути. Он принадлежит семейству Р-катенинов (P-cat), отличающихся наличием особых armadillo-повторов, находящихся в центре молекулы (Gottardi, Peifer, 2008; Xing et al., 2008). Через эти повторы, но разные их участки, Р-катенин может соединяться (1) с трансмембранными Е-кадеринами, (2) инактивирующим цитоплазматическим комплексом Adenomatous polyposis coli (АРС — см. Aoki, Taketo, 2007), включающим наряду с АРС, также другие белки, в частности, платформенный белок Axin и киназы Casein kinase I (CKI) и Glycogen synthase kinase-3b (GSK-3b); в ядре 3-катенин способен соединяться (3) с транскрипционными факторами семейства LEF/TCF (Gottardi, Gumbiner, 2001; Clevers, 2006). В сравнении с 3-катенином киназа GSK-ЗЬ показывает большее сродство с АРС и поэтому она вытесняет из комплекса 3-катенин, который захватывается протеосомами и переваривается. Транскрипционные белки LEF/TCF в неактивном состоянии блокированы репрессорами Groucho (Gro) и Carboxy-terminal binding protein (CtBP). В отсутствии Wnt-сигнала (рис. 9.10а) P-cat фосфорилируется ки-назой GSK-3J3 и в этом состоянии подвергается протеосомному разложению (Cadigan, Liu, 2006). Поэтому АРС-комплекс называют часто деградационным. Передача Wnt-сигнал требует участия второго трансмембранного рецептора LRP (LDL receptor-related protein), имеющего лишь одну проходящую через мембрану спираль. При возбуждении лигандом Wnt спаренных рецепторов LRP связывает аксин, а GSK-ЗР фосфорилирует Dishevelled. Как результат, АРС-комплекс не может фосфорилировать Р-катенин. Последний отделяется от комплекса, накапливается в цитозоле и далее попадает в ядро, где в составе своего транскрипционного активатора вытесняет репрессор Groucho (Gro), делая транскрипционный комплекс LEF/TCF активным. Из числа кодируемых генов отметим туспротоонкогены, мутантные формы которых связаны с разными типами рака. Для транскрипционного включения разных генов (3-катенин взаимодействует с многими белками, такими как ТАТА-связывающий белок, CREB-связывающий белок, MED12 и другими (Stadeli et al., 2006). В числе регуляторов транскрипции следует также отметить комплекс, который включает циклин-зависимую киназу 8 (Cdk8), связанную с циклинами С-типа (СусС). У мух этот комплекс действует как супрессор транскрипционного фактора E2F (Morris et al., 2008). Этот фактор включает экспрессию многих генов, в том числе AXIN1, AX1N2 и SIAH1, продукты которых участвуют в деградации катенина. Следовательно, E2F в данном случае будет в конечном итоге подавлять активность транскрипционного комплекса катенин/LEF/TCF Кроме того, E2F в случае семейной формы полипоза толстой кишки находится под негативным контролем фосфобелка pRb. Напомним, что pRb связывает E2F, т.е. по функции является опухолевым супрессором. Мутантные pRb не способны связывать E2F и тем самым ограничивать активность этого транскрипционного фактора. В случае семейной формы полипоза толстой кишки мутантные pRb не отмечены. Более того, наблюдается повышенная экспрессия pRb. Это может свидетельствовать в пользу того, что pRb в данной форме рака функционирует как онкобелок (Bernards, 2008).
Репарационные процессы
Нормальные клетки отвечают на стресс и связанное с ним повреждение ДНК изменением регуляторного контура процессов размножения и апоптоза (индуцированной клеточной смерти), а также включением репарационных механизмов. Имеется два типа повреждений ДНК, восстанавливаемых в одном случае с помощью обратной химической реакции, в другом — удалением поврежденных участков и их заменой новой синтезированной ДНК (Cooper, 2000; Жимулев, 2003). К первым относится, например, фотореактивация. Под действием УФ-излучения соседние пиримидины ДНК, такие как тимин, способны отсоединяться от нуклеотидов комплементарной нити (в случае тимина от аденина) и соединяться между собой в димер с образованием циклобутанового кольца. Солнечный свет дает энергию для обратной реакции (фотореактивации) — разрыва циклобутанового кольца и восстановления связей между пиримидинами и пуринами. Другим химически обратимым повреждением ДНК является ее алкилирование — перенос метиловой или этиловой групп на кислород в шестом положении (О6) пуринового кольца. В случае метилированного гуанина (06-метилгуанина) он не найдет себе пары, поскольку спаривается с тимином (неметилированный гуанин спаривается с цитозином). Известно несколько репарационных систем, специализирующихся на удалении поврежденного участка ДНК (Hoeijmakers. 2001; Brosh, Bohr, 2007). Один механизм связан с вырезанием неспаренного основания, возникшего в результате повреждения, например, дезаминации цитозина и превращения его в урацил (репарация с удалением основания — BER, base-excision repair). Реакция удаления осуществляется с помощью ДНК-гликозилазы, разрывающей связь основания с сахаром. Далее в работу вступают особая АР-эндонуклеаза, опознающая сайт без пурина или пиримидина (apurinic apyridiminic. АР), фосфодиэстераза и ряд других ферментов (Жимулев, 2003). Отметим, что BER-репаросома может вырезать и соседние с поврежденным основания, но общая длина вырезаемого отрезка не превышает шести нуклеотидов. Другой механизм связан с вырезанием последовательности нуклеотидов, включающей и поврежденные основания, большей длины (до 29) — репарация с удалением нуклеотидов (NER, nucleotide-excision repair). У человека выявлено шесть генов XP (A-G) и вспомогательный ген ERCCI, продукты которых образуют NER-репаросому. NER-репаросома включает белки, опознающие повреждение, геликазы и особые нуклеазы, надрезающие ДНК (отступя на несколько нуклео-тидов по обе стороны от поврежденного участка). Мутации в ХР-генах являются причиной пигментной ксеродермы (xeroderma pigmentosum — сверхчувствительность к УФ-облучению, появление красных пятен на коже, коросты) и трихотиодистрофии (сверхчувствительность к УФ-облучению, недостаток серы в волосах, кожные аномалии, физическое и умственное недоразвитие). Ксеродерма способна трансформироваться в рак; случаев рака, связанных с трихотиоди-строфией, не зарегистрировано. Транскрипционный фактор р53 является ключевым в активации NER-репаросомы. При стрессовых повреждениях ДНК он включает экспрессию генов Gadd45 и р48ХРЕ, белковые продукты которых обеспечивают доступ NER-репаросомы к поврежденному сайту. Репарация неспаренных пар оснований ДНК (мисмэтч-репара-ция — mismatch (excision) repair, MMR) представляет третью эксцизи-онную систему (Cooper, 2000; Жимулев, 2003), исправляющую в основном ошибки репликации. У человека мутации в генах этой системы являются причиной наследственного неполипозного рака толстой кишки. Основными являются следующие гены MSH2-3 (mutS homolog 2-3), MLH1-3 (mutL homolog 2-3), PMS1-2 (postmeiotic segregation increased 2), TFGBR2 и др. При устранении двойных разрывов ДНК ключевую роль играют две киназы, относящиеся к фосфатидилинозитЗ-киназам (Kobayashi et al., 2008). Они кодируются генами ATM (Ataxia-Telangiectasia Mutated) и ATR (ATM-RAD3-related). Первое обозначение производно от названия болезни (атаксия-телангиэктазия, или синдром Луи-Бара), возникающей в результате мутации в ATM-гене. Синдром проявляется в нейромоторной дисфункции (атаксия), в расширенных кровеносных сосудах глаз (телангиэктазия), предрасположенности к раковым заболеваниям в раннем возрасте. Киназа ATM показывает активность при устранении двунитевых разрывов ДНК, вызванных главным образом ионизирующей радиацией. Киназа ATR участвует в устранении более широкого спектра повреждений, в том числе возникающих в процессах репликации; она является также сенсором ультрафиолетовых повреждений ДНК. У человека мутации в сплайсинге /177?-гена, приводят к «птицеголовой низкорослое™» — синдрому Секкела (названного по имени педиатра, изучавшего данный синдром: Helmut G.P. Seckel, 1900-1960) (O'Driscoll et al., 2003). Эукариотическая клетка использует два сигнальных каскада для устранения двойных разрывов: (1) негомологичное воссоединение концов (NHEJ, non-homologous end joining) и (2) гомологическую рекомбинацию (Бабынин, 2007; San Filippo et al., 2008). Второй путь может быть подразделен на консервативный механизм генной конверсии и неконсервативный механизм отжига комплементарных цепей ДНК (SSA, single-strand annealing). Последний механизм используется в тех случаях, когда по обеим сторонам разрыва нити ДНК присутствуют прямые повторы (Sugawara et al., 2008; Mansour et al., 2008). Первый шаг связан с отсечением (резекцией) 5' концов между повторами с помощью с экзонуклеазы. Длинные 3' концы обволакиваются репликационным белком A (RPA, replication protein А), который на следующем шаге замещается белком RAD52. RAD52 фиксирует комплементарные отрезки нитей между повторами. Свободные гетерологичные 3' концы в точке вхождения однонитевого хвоста в область двунитевой ДНК удаляются RAD1-RAD10 эндонуклеазой. Концы сшиваются (лигируются). При NHEJ на разорванные концы с обеих сторон бреши «садятся» гетеродимеры Ku70/Ku80, защищающие концы ДНК от распада и служащие платформой для ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PK, DNA-dependent protein kinase). Последние связывают концы ДНК и рекрутируют нуклеазу ARTEMIS, действующую в направлении 5'—>3'. Далее в работу включается ДНК-полимераза ц (или А.) и завершается процесс сшивкой нитей с помощью ДНК-лигазы LigIV/XRCC4 (подробнее см.: Tsukamoto, Ikeda, 1998; Dudasova, 2004). При консервативной гомологичной рекомбинации двойные разрывы опознаются особым репарационным комплексом MRN, кодируемым тремя генами: MRE11 (Meiotic recombination protein-11), RAD50 и NBS1 (Nijmegen breakage syndrome 1). Мутации в последнем гене ведут к ниймегеновскому синдрому (названному по голландскому городу Ниймеген, в котором был зарегистрирован этот синдром). Клиническая картина заболевания включает радиочувствительность, нарушение иммунитета, геномную нестабильность, выливающуюся часто в рак. Мутация в гене RAD50 дает один из вариантов ниймегеновского синдрома. Кодируемый геном белок осуществляет сцепление разорванных концов, которые благодаря этому удерживаются вместе (Czornak et al., 2008; Riches et al., 2008). Наконец, мутации в гене MRE11 являются причиной АТ-подобного расстройства (АТ-like disorder). MRE11 кодирует эндонуклеазу, способную разрывать связи между нуклеотидами. Но она действует только в направлении У—>5'. Два MRN-комплекса садятся на концы нитей ДНК с обеих сторон от бреши, образованной разрывом. В этом состоянии они рекрутируют ATM. Ключевую роль в этом играет NBS1. Комплекс подготавливает 5' концы для деградации, которые затем отрезаются с помощью нуклеаз (Zhu et al., 2008). MRN через NBS1 активирует АТМ-киназу, которая фосфорилиру-ет С-терминальные хвосты гистонов Н2АХ-варианта, непосредственно соседствующих с разрывом. Фосфорилированные пистоны в свою очередь активируют медиатор сверочных точек MDC1 (mediator of DN A damage checkpoint protein-1), который являются амплификатором (умножителем) ATM каскадов. Рекрутируемые дополнительные АТМ-киназы (по другим сценариям дополнительные ATM-MRN комплексы) расширяют область фосфорилирования Н2АХ-гистонов вокруг бреши. В результате изменяется структура хроматина, что в свою очередь способствует накоплению вокруг разорванных концов ДНК ряда белков, являющихся субстратом для киназной активности ATM. У Saccharomyces cerevisiae действует аналогичный MRX-комплекс, в котором третий член Xrs2 является гомологом NBS1 человека. У этих дрожжей к репарации подключаются Sae2, геликаза Sgsl и нук-леазы Exol (Takeda et al., 2007; Mimitou, Symington, 2008). У человека им соответствуют гомологичные белки CtIP, BLM, EXOl и; кроме того, участвует нуклеаза Dna2 (Zhu et al., 2008). BLM-геликаза (член RecQ-семейства) индуцирует нуклеолитическую активность hExol, действующую в направлении 5'—>3', и отсечение (резекцию) 5'-концов разорванных ДНК. В итоге образуются У ОН однонитевые свободные хвосты. Эти хвосты являются мишенями рекомбиназ Rad51, которые образуют вокруг хвоста нуклеопротеиновый филамент (Nimonkar et al., 2008). Связанные с Rad51 однонитевые хвосты способны спариваться со сходными нуклеотидными последовательностями гомологичной хромосомы (образование D-петли) и достраиваться, выполняя функцию праймеров в репарационном синтезе ДНК. Образование Rad51 -филаментов и формирование D-петель регулируется также BRCA2 (Boulton, 2006). Потеря этих регуляторных функций в результате мутации гена BRCA2 ведет к раку молочной железы (см. дальше). Отмечено также взаимодействие BRCA1 с Rad51, но оно не является прямым. На заключительном этапе достроенные нити сшиваются ДНК-лигазами. Важную роль в механизмах репарации играют процессы убикви-тинирования. Ube 13 необходим для сборки нуклеопротеинового фи-ламента. Одним из субстратов Ube 13 является Н2АХ; полиубиквити-нирование этого варианта гистона изменяет хроматиновую структуру вокруг разрыва. Другим катализатором убиквитинирования хроматина выступают белки, связанные с анемией Фанкони (FA, Fanconi anemia). Это заболевание характеризуется деформацией пальцев и другими скелетными нарушениями, связанными с костно-мозговыми процессами, дополнительно возникают урогенитальные, сердечные, желудочно-кишечные нарушения, геномная нестабильность увеличивает вероятность возникновение рака (Wang, 2007). Гены, мутации в которых вызывают анемию Фанкони, кодируют FancA/B/C/E/F/G/L/M, FancD2, рекомбиназу BRCA2/FancDl, комплексирующуюся с Rad51 и Dssl, PALB2/FancN в качестве партнера BRCA2, 5'—3' геликазу BRIPI/FancJ, зависимую от BRCA1. FA-комплекс активируется ATR-киназой. BRCA1-зависимому убиквитинированию подвергается CtlP. ак было сказано, киназа ATR имеет более широкий спектр активности и, в частности, контролирует процессы восстановления одно-ниточных разрывов, включая разрывы, сопровождающие процессы репликации. Такие разрывы обнаруживаются репликационным белком A (RPA, replication protein А), который комплексируется вокруг разрыва (Shiotani, Zou, 2009). С этим белком соединяется регулятор-ный белок ATRIP (ATR-interacting protein), который в свою очередь комплексируется с ATR. Наряду с комплексом RPA/ATRIP/ ATR процесс репарации требует участия ряда других белков, из которых ключевыми являются RAD17 и кольцевой тримерный комплекс, образованный белками RAD9-RAD1-HUS1 (и обозначаемый также как 9-1-1). RAD17 рекрутирует комплекс 9-1-1 к поврежденному сайту, но его рекрутирующая активность зависит от RPA. Киназная активность ATR на поврежденном сайте определяется ТорВР 1 (Topoisomerase (DNA) II binding protein 1) — белком, связывающим топоизомеразу II. В свою очередь ATR и ATM могут фосфорилировать (активировать) ТорВР 1 (Burrows, Elledge, 2008). Активация ATR при устранении двойных разрывов ДНК зависит от ATM (Kobayashi et al., 2008). Оба сенсора, как ATM, так и ATR, фосфорилируют при разрывах ДНК также BRCA1. Гены BRCA1 и BRCA2 ассоциированы с раком молочной железы. Это заболевание существует в двух формах, семейной (наследственной), передаваемой в поколениях, и спорадической, поражающей с возрастом лишь данную конкретную женщину. Первая связана с мутациями в BRCA1. У 85% женщин, унаследовавших му-тантный BRCAl-аллелъ, развивается рак (Клаг, Каммингс, 2007). В отличие от спорадического семейный рак протекает более тяжело и сопровождается высоким митотическим индексом, мутациями в р53 (70-80%), резким снижением экспрессии рецепторов для эстрогена и прогестерона (Hartman, Ford, 2003). Спорадическая форма часто вызывается мутациями в генах erbB-2, с-тус и некоторых других. Эта форма рака молочной железы не всегда сопровождается мутациями в Я7?С4-генах. Их инактивация в этом случае может осуществляться через процессы метилирования. Из 120 генов, участвующих в восстановлении поврежденной ДНК, мутации лишь в небольшой их части приводят к раковым заболеваниям у человека.
