Рак — это тяжелое заболевание, связанное с поражением (повреждением) наследственного аппарата и распадом регуляторных механизмов транскрипционной активности, результатом чего является нерегулируемое размножение клеток. Раковые заболевания делятся на четыре основные группы: карциномы, саркомы, лейкемии и лимфомы. Карциномы, составляющие до 90% случаев рака у человека, являются злокачественным перерождением эпителиальных клеток. Саркомы — опухоли соединительных тканей (мышц, костей, хрящей и т.д.). Лейкемии и лимфомы, составляющие вместе до 8% раковых заболеваний человека, поражают клетки крови и иммунной системы соответственно. До последнего времени главную причину рака видели исключительно в возникновении мутаций в небольшом числе генов, определяющих ключевые процессы клеточного цикла. Соответствующая клональная генетическая модель развития рака из единственной мутантной клетки была сформулирована более 30 лет назад и к настоящему времени хорошо разработана и обоснована. Согласно этой модели последовательные генетические изменения ведут к нарушению клеточного цикла и к клональному отбору таких клеток, показывающих разные уровни опухолевой гетерогенности.
Клеточный цикл
Подавляющее большинство раковых заболеваний является результатом различных нарушений клеточного цикла. Поэтому рак часто рассматривают как болезнь клеточного цикла (Malumbres, Carnero, 2003). Для эукариотической клетки характерна определенная последовательность событий между делениями, составляющая клеточный цикл. Основные события клеточного цикла связаны с удвоением генома (S-фаза), перераспределением и соединением ДНК в два новых генома во время митоза (М-фаза). Период между митозом и S-фазой обозначают через G,, между S и М — через G2. Клеточный цикл контролируется большим комплексом белков, центральными из которых являются циклины (Сус), комплек-сирующиеся с циклин-зависимыми киназами Cdk. Циклины, как о том говорит их название, показывают периодический характер синтеза и распада. Киназы Cdk способны фосфорилировать многие белки, но эта их каталитическая активность возможна лишь в соединении с циклинами. Например, Cdk2 связывается с циклином В, образуя комплекс, называемый фактором созревания. Фактор созревания запускает через фосфорилирование белков ряд ключевых процессов митоза, в частности, конденсацию хроматина (через фосфорилирование конден-сина), разрушение ядерной мембраны (через фосфорилирование ламинов), образование веретена и т.д. После окончания митоза в работу вступают протеин-фосфатазы, которые дефосфорилируют белки (La Thangue, 2002). Если в клетке не синтезируется циклин В, то Cdk2 является неактивной и митоз задерживается. С другой стороны, если приостанавливается деградация циклина, то клетка не может выйти в следующую, постмитотическую фазу клеточного цикла. Переход G, —> S контролируется циклин-зависимыми киназами (Cdk4,6 и Cdk2). Cdk4,6 активируются циклинами семейства D (CycD), Cdk2 — циклинами Е-типа в фазе G, и циклинами А-типа в поздней G/S-фазе. Экспрессия, например, циклина D начинается в ответ на воздействие ростовых факторов, сигналы от которых передаются в ядро через Ras/Raf/ERK-сигнальный путь. Белки семейств ink4 и CIP/KIP, в частности, р16 и р18 из первого семейства и p21Wafl/cipl, p27Kipl, p57Kip2 из второго семейства, являются ингибиторами циклинзависимых киназ. Более сложная ситуация возникает при разного рода нарушениях клеточного цикла. Рассмотрим в качестве примера случаи повреждения ДНК, связанные с ее разрывом. Чтобы восстановить целостность ДНК необходимо участие многих белков, которые можно подразделить на сенсоры, способные распознать тип повреждения, медиаторы, осуществляющие связь между молекулами, трансдукторы, передающие сигнал о повреждении ДНК на эффекторы; последние определяют характер ответных реакций клеток на повреждение (Abraham, 2001; Niida, Nakanishi, 2006). Клетка может различным образом реагировать на повреждения ДНК, в одних случаях использовать репарационные механизмы, в других приостанавливать клеточный цикл, а при сильных повреждениях прибегать к апоптозу. К сенсорам, тестирующим разрывы ДНК, относятся белковые комплексы MRN, RAD17 и 9-1-1 (см. дальше). Из медиаторов в первую очередь следует отметить белки, содержащие домены с так называемым BRCA1 С-терминальным повтором. Наиболее важными среди них являются BRCA1, связанный с раком молочной железы, р53-связывающий белок (р53ВР1), белок, связывающий топоизомеразу (TopBPl). Трансдукторы представлены особыми фосфатидилинозитЗ-киназами (ATM, ATR) и их связывающими белками (например, ATRIP для ATR). Роль трансдукторов выполняют также протеинкиназы так называемых сверочных точек клеточного цикла. Таковы Chkl, Chk2. Данный комплекс белков контролирует завершенность событий, имеющих место в каждой фазе, и останавливает клеточный цикл, если возникают какие-либо нарушения, например, разрыв нитей ДНК. Наиболее изучены три сверочные точки контроля (checkpoints), отвечающих кратким периодам клеточного цикла, когда клетки наиболее чувствительны к возможным повреждениям. Эти чувствительные периоды выявлены в конце фаз G,, G2H M (Cooper, 2000). Большинство нарушений клеточного цикла, сопряженных с раковыми заболеваниями, приходится на Gj-фазу и G/S-переход (Malumbres, Camero, 2003). Поэтому здесь мы рассмотрим лишь эту стадию клеточного цикла.
Эффекторную функцию несут уже упоминавшиеся комплексы цик-линов с циклин-зависимыми киназами, которые фосфорилируют различные низовые белки. Другим важным комплексом эффекторов являются тирозинпротеин фосфатазы Cdc25(A,B,C). Они осуществляют дефосфорилирование белков. Так, Cdc25A активирует Cdk2/CycA-комплекс при переходе G, -> S. При разрывах ДНК киназа Chk2 фос-форилирует Cdc25A и тем самым метит его для убиквитин-зависимо-го разложения. Соответственно переход G, —> S приостанавливается (Abraham, 2001). Транскрипционные факторы являются третьей категорией белков с эффекторными функциями. Ключевым элементом, контролирующим прохождение фазы G,, является транскрипционный фактор р53 (см. Malumbres, Carnero, 2003; Чумаков, 2007), образующий тетрамер и получивший название «сторожа» генома (care taker), функционирующего в роли последнего бастиона в системе защиты организма от рака (Ридли, 2008). Контрольные функции этого белка связаны с тестированием состояния нитей ДНК, в первую очередь на наличие разрывов. Если ДНК имеет разрывы, то увеличивается уровень р53 и приостанавливается переход из Gj в S-фазу Конкретно р53 активирует транскрипцию гена р21, кодирующего ингибиторы циклинзависимых киназ (Cdk), например, р16 и р18 из тк4-семейства. Одновременно в зависимости от условий р53 индуцирует процесс апоптоза (через рецепторы Fas/Apol) или антиан-гиогенеза (через TSP1/GD-AIF — ингибиторы ангиогенеза, т.е. процессов образования кровеносных сосудов), или включает гены, кодирующие репарационные белки (р48, GADD45), белки, изменяющие клеточный редокс-потенциал (Pig3), про- и анти-апоптозные белки (соответственно Вах, Вс12) в митохондриях. Если разрывов нет или они ликвидированы, то уровень р53 падает. Соответственно повышается уровень активных киназных комплексов Cdk4,6/CycD, которые фосфорилируют белок Rb (pRb). Фосфобелок Rb, обладающий неспецифической ДНК-связывающей активностью, является важным репрессором транскрипции, действующим через механизмы связывания и, как результат, инактивации (1) транскрипционного фактора E2F, (2) гистон-деацетилазы (HDAC) и (3) хроматин-ремодулирующего комплекса. Неполное фосфорилирование белка Rb (с помощью Cdk4,6) ведет к отсоединению от комплекса HDAC, которая через ряд белков способна запустить экспрессию генов, кодирующих циклины Е-типа. Эти циклины комплексируются с Cdk2-ra-назой, которая дополнительно фосфорилирует pRb по нефосфорили-рованным остаткам. pRb при его полном фосфорилировании отсоединяется от транскрипционного фактора E2F 1(2,3) который включает каскад примерно из 30 генов S-фазы, что и будет свидетельствовать о завершении G,/S-nepexofla. Выключение генов клеточного цикла в результате мутации ведет к неограниченному размножению клеток. Примером может служить ген Rb. Различные формы карциномы часто сопряжены с амплификацией CCND1-гена, кодирующего циклин D1. В культивируемых клетках саркомы с мутантным геном Rb белок Rb не образуется. Как результат, E2F находится постоянно в активном состоянии, а сам клеточный цикл уже мало зависит от регулирующего действия факторов роста. Rb может быть также мишенью онкогенных белков из опухолеродных ДНК-содержащих вирусов, таких как SV-40 (simian virus 40), аденовирусы, папиломавирусы человека. Эти белки инактивируют Rb, и тем способствуют тому же эффекту длительной транскрипционной неактивности Rb и нерегулируемому размножению клеток. В упрощенном виде клеточный цикл и, как результат, процессы деления клеток находятся под контролем трех групп генов — (1) про-тоонкогенов, индуцирующих процессы размножения клеток, (2) ге-нов-супрессоров опухолей, подавляющих процессы роста, и (3) генов, участвующих в восстановлении (репарации) поврежденных ДНК (Клаг, Каммингс, 2006). Гены последней категории часто объединяют с генами второй категории.
Протоонкогены представляют собой нормальные гены, несущие последовательности, которые гомологичны онкогенам вирусов. Онкогенами называют специфические гены вирусов, вызывающие раковое перерождение клеток. Мутантные формы протоонкогенов способны также индуцировать рак и поэтому они являются онкогенами. Таким образом, здоровая форма гена называется протоонкогеном, мутантная — онкогеном. Причиной многих форм рака у животных и человека являются РНК-содержащие вирусы (ретровирусы), которые для синтеза ДНК используют обратную транскриптазу. Большинство ретровирусов содержат лишь три гена: gag, кодирующий протеазу и структурные вирусные белки, pol, кодирующий интегразу и обратную транскриптазу, env, участвующий в образовании вирусной оболочки (Weiss, 2001; Попов, 2008). Геномы ряда ретровирусов включают дополнительные последовательности. Так, вирус саркомы Рауса (RSV) способен трансформировать эмбриональные фибробласты цыпленка в раковые. Близкий птичий вирус лейкоза (ALV —avian leukosis virus), относящийся к тому же роду Alpharetrovirus, может размножаться в тех же клетках, но не вызывает их злокачественного перерождения. Сравнение соответствующих провирусов (рис. 9.6) показывает присутствие в RSV особой src-последовательности, которая, таким образом и отвечает за злокачественное перерождение клеток, src-последо-вательность кодирует протеинтирозин-киназу (Cooper, 2000). Клетка вырабатывает много белков, содержащих тирозин-киназ-ный домен. Отметим важные мембранные рецепторы, такие как PDGFR, NGFR, лигандами для которых являются различные факторы роста, инсулиновый рецептор. У этих рецепторов внутриклеточный С-терминальный хвост несет тирозин-киназный домен. Некоторые рецепторы не имеют встроенных киназных доменов. Но они могут соединяться с тизозин-киназными белками (Krause, Etten, 2005). В качестве примера можно указать на цитокиновые рецепторы. Многие из тизозин-киназных белков, комплексирующихся с цитокиновыми рецепторами, как раз и принадлежат к семейству Src. При заражении вирусом саркомы Рауса образуется избыток вирусных Src-белков, которые будут поддерживать постоянную высокую активность цитоки-новых рецепторов. Клеточные src-гены, кодирующие тирозин-кина-зы, находятся под жестким регуляторным контролем и в норме не ведут к раковому перерождению клеток. Ген akt. Этот ген кодирует Akt-киназу, которая в неактивном состоянии связана с фосфатидилинозит (3,4,5)-трифосфатом (ФИФ3 — Р1Р3)-ФИФ3 является фосфорилированным производным ФИ(3,4)-дифосфата (ФИФ2). Фосфорилирование осуществляет особая фосфатидилинозит-киназа (ФИЗ-К — PI3-K), которая сама может быть активирована сигналами, опосредуемыми ЗТМ-рецепторами или рецепторами с тирозин-киназным внутриклеточным доменом (например, инсули-новым рецептором). Akt-киназа активируется и теряет связь с ФИФ3 после ее фосфорилирования с помощью другой киназы PDK, также связанной с ФИФ3 . В цитоплазме Akt-киназа фосфорилиру-ет различные белки. Один из них — проапоптозный белок BAD, фос-форилируемый по Serl36. Нефосфорилированный белок BAD связывает важный комплекс Bcl-2/Bcl-X, который в активном (несвязанном) состоянии ингибирует процесс апоптоза. Таким образом, Akt-киназа, фосфорилируя BAD, может остановить процесс апоптоза. Показано, что Akt-киназа может фосфорилировать и ингибировать протеазу Caspase-9 (у человека), связанную с инициацией апоптоза. В норме эта каспаза является ключевым членом сигнального пути, описываемого следующей упрощенной схемой: рецептор клеточной смерти Fas' передает сигнал на Caspase-8, которая разрезает регуля-торный белок Bid (из семейства Вс1-2), в результате чего тот перемещается в митохондрии и индуцируют выброс из них цитохрома с; последний необходим для активации адаптерного белка Apaf-1, который связывает две молекулы Caspase-9; те саморазрезаются и в таком усеченном виде способны действовать как протеазы для других белков.Транскрипционный фактор FKHR из forkhead-семейства в цитоплазме в фосфорилированном (через Akt-киназу) состоянии связан с белками семейства 14-3-3 и является неактивным. Белок PTEN (о нем дальше) способен дефосфорилировать FKHR и разрушить комплекс; освобожденный FKHR поступает в ядро и включает там транскрипцию ряда генов, в том числе гена Fas ligand (FasL), кодирующего проапоптозный белок, являющийся лигандом рецептора Fas. Здесь мы имеем пример еще одного сигнального пути с участием Akt-киназы, отрицательно регулирующего процесс апоптоза. В дополнение к этому Akt-киназа может положительно влиять на транскрипцию противоапоптозных генов через активацию нейронного фактора каппа В (NF-кВ). Этот транскрипционный фактор локализован в цитоплазме, где он образует комплекс с белком 1кВ. Akt фос-форилирует 1кВ-киназу, которая разрушает комплекс, освобождая NF-кВ. Последний перемещается в ядро, включая гены, повышающие сопротивляемость клеток к неблагоприятным факторам. Другой мишенью Akt-киназы является mTOR(mammalian target of гаратуст)-киназа, играющая ключевую роль в росте и размножении клеток через фосфорилирование протеинкиназы SGK и дополнительное фосфорилирование Akt-киназы (Hong et al, 2008; Toker, 2008). Обе киназы фосфорилируют белок р27к|р, который в активном состоянии остается в цитоплазме и, таким образом, не способен ингибировать циклин-зависимые киназы Cdk4,6 и Cdk2. Эти киназы контролируют переход клетки из фазы G, в фазу S (см. раздел 9.3.1). Ингибиторы Akt-киназы индуцируют экспрессию р27, возможно, на поздних стадиях G, и в S-фазе клеточного цикла (Gaurisankar, Stacey, 2004). Убик-витин лигаза Mdm2 (mouse double minute 2), представляющая также онкобелок, блокирует в ядре транскрипционную активность р53. Условием поступления Mdm2 в ядро является его фосфорилирование по сериновым остаткам 166 и 186, которое осуществляется Akt-киназой. Мутация, затрагивающая сайты фосфорилирования Mdm2, ведет к тому, что этот онкобелок не поступает в ядро и не подавляет активность р53. Фосфорилированная лигаза Mdm2 образует в ядре комплекс с р53, связываясь с теми сайтами этого транскрипционного фактора, которые важны для его соединения с ДНК. Одновременно Mdm2 метит р53 для его последующего разрушения и перемещает его из ядра в цитоплазму (Bose, Ghosh, 2007). Одной из мишеней р53 является ген Mdm2. Здесь, следовательно, мы имеем пример петли обратной связи. Благодаря Akt и Mdm2 уровень р53 поддерживается в нормальных клетках на низком уровне. При повреждении ДНК АТМ-киназа (о ней дальше) особым образом фосфорилирует р53, в результате чего становится невозможной образование комплекса р53 + Mdm2. Как результат, р53, по меткому выражению, страж генома (guardian of the genome — Vogelstein et al., 2000), включает экспрессию генов репарации, а в случае сильного повреждения индуцирует процесс апоптоза через Fas-рецептор. Низкий уровень апоптозной активности, связанный, в частности, с мутациями в гене р53, сопряжен с раком. С другой стороны избыточный уровень апоптозной активности данного типа связан с ревматоидным артритом. Отметим, что одной из транскрипционных мишеней р53 является ген р21. Akt-киназа может фосфорилировать р21 по треонину 145 и тем самым, как и в случае с р27, блокировать активность этого ингибитора циклин-зависимых киназ в ядре. В нервных клетках Akt-киназа активирует различные транскрипционные факторы, в том числе и NGFI-A, контролирующий гены, продукты которых повышают сопротивляемость нервных клеток. Отметим также, что, киназа Akt-1 положительно действует на развитие ЕгЬВ2-индуцированного рака груди (Cheng et al., 2007). Этому типу рака, поражающему 15-20 процентов женщин, болеющих раком груди, сопутствует повышенная экспрессия рецептора ЕгЬВ-2 (также известного как HER2/neu — Human Epidermal growth factor Receptor 2). Ген ras. Этот ген кодирует мембранный Ras-белок, являющийся ключевым элементом Ras/Raf/ERK-сигнального пути. Более 30% опухолей связаны с мутантными формами Ras-белков. Ras-белок содержит 189 аминокислотных остатков. Замены аминокислот в 12 и 61 положениях ведут к тому, что белок не может изменить функциональную конформацию и из активного стать неактивным (Клаг, Каммингс, 2006). Переход от протоонкогена в онкоген определяется единичными мутациями. Через Ras/Raf/ERK-сигнальный путь опосредуется действие на клетку различных факторов роста, таких как эпидермальный (EGF) или инсулиновый (IGF) ростовые факторы. При соединении этих факторов с соответствующим рецептором (для EGF это будет рецептор ErbB с протеинтирозин-киназным внутриклеточным доменом), рецептор возбуждается и передает сигнал на Ras-белок, который взаимодействует с Raf-протеинкиназой, та в свою очередь с МЕ-киназой (МЕК), а эта последняя фосфорилирует ER-киназу (ERK) по двум остаткам — тирозину и треонину. Ингибиторы МЕ-киназы индуцируют экспрессию р27 главным образом в Gl-фазе клеточного цикла (Gauris-ankar, Stacey, 2004). ERK поступает в ядро и фосфорилирует фактор Elkl, который в комплексе с SRF (serum response factor) включает транскрипцию ранних генов, таких, как/as. Отметим, что в данном сигнальном каскаде, кроме ras, протоонкогенами являются erbB и/а?. В некоторых случаях между рецептором и Ras вклиниваются дополнительные белки. Другой мишенью Ras/Raf/ERK-каскада является ки-наза р90 RSK2 (ribosomal S6 kinase 90 kD polypeptide 2), которая после фосфорилирования может взаимодействовать с CREB, фосфорилируя этот фактор по зег133-остатку Мутация в гене, кодирующем эту кина-зу, сопряжена с синдромом Коффина-Лоури. Ras-белок является ключевым элементом еще двух близких сигнальных каскадов (МАРК р38 и JNK/SAPK), развертывающихся при действии на клетку различных стрессоров. Второй из этих каскадов фосфорилирует белок Jun, который комплексируется с продуктом про-тоонкогена/оу, образуя транскрипционный фактор АР-1. АР-1 способен блокировать действие факторов р21 и р53.
Клеточный цикл
Подавляющее большинство раковых заболеваний является результатом различных нарушений клеточного цикла. Поэтому рак часто рассматривают как болезнь клеточного цикла (Malumbres, Carnero, 2003). Для эукариотической клетки характерна определенная последовательность событий между делениями, составляющая клеточный цикл. Основные события клеточного цикла связаны с удвоением генома (S-фаза), перераспределением и соединением ДНК в два новых генома во время митоза (М-фаза). Период между митозом и S-фазой обозначают через G,, между S и М — через G2. Клеточный цикл контролируется большим комплексом белков, центральными из которых являются циклины (Сус), комплек-сирующиеся с циклин-зависимыми киназами Cdk. Циклины, как о том говорит их название, показывают периодический характер синтеза и распада. Киназы Cdk способны фосфорилировать многие белки, но эта их каталитическая активность возможна лишь в соединении с циклинами. Например, Cdk2 связывается с циклином В, образуя комплекс, называемый фактором созревания. Фактор созревания запускает через фосфорилирование белков ряд ключевых процессов митоза, в частности, конденсацию хроматина (через фосфорилирование конден-сина), разрушение ядерной мембраны (через фосфорилирование ламинов), образование веретена и т.д. После окончания митоза в работу вступают протеин-фосфатазы, которые дефосфорилируют белки (La Thangue, 2002). Если в клетке не синтезируется циклин В, то Cdk2 является неактивной и митоз задерживается. С другой стороны, если приостанавливается деградация циклина, то клетка не может выйти в следующую, постмитотическую фазу клеточного цикла. Переход G, —> S контролируется циклин-зависимыми киназами (Cdk4,6 и Cdk2). Cdk4,6 активируются циклинами семейства D (CycD), Cdk2 — циклинами Е-типа в фазе G, и циклинами А-типа в поздней G/S-фазе. Экспрессия, например, циклина D начинается в ответ на воздействие ростовых факторов, сигналы от которых передаются в ядро через Ras/Raf/ERK-сигнальный путь. Белки семейств ink4 и CIP/KIP, в частности, р16 и р18 из первого семейства и p21Wafl/cipl, p27Kipl, p57Kip2 из второго семейства, являются ингибиторами циклинзависимых киназ. Более сложная ситуация возникает при разного рода нарушениях клеточного цикла. Рассмотрим в качестве примера случаи повреждения ДНК, связанные с ее разрывом. Чтобы восстановить целостность ДНК необходимо участие многих белков, которые можно подразделить на сенсоры, способные распознать тип повреждения, медиаторы, осуществляющие связь между молекулами, трансдукторы, передающие сигнал о повреждении ДНК на эффекторы; последние определяют характер ответных реакций клеток на повреждение (Abraham, 2001; Niida, Nakanishi, 2006). Клетка может различным образом реагировать на повреждения ДНК, в одних случаях использовать репарационные механизмы, в других приостанавливать клеточный цикл, а при сильных повреждениях прибегать к апоптозу. К сенсорам, тестирующим разрывы ДНК, относятся белковые комплексы MRN, RAD17 и 9-1-1 (см. дальше). Из медиаторов в первую очередь следует отметить белки, содержащие домены с так называемым BRCA1 С-терминальным повтором. Наиболее важными среди них являются BRCA1, связанный с раком молочной железы, р53-связывающий белок (р53ВР1), белок, связывающий топоизомеразу (TopBPl). Трансдукторы представлены особыми фосфатидилинозитЗ-киназами (ATM, ATR) и их связывающими белками (например, ATRIP для ATR). Роль трансдукторов выполняют также протеинкиназы так называемых сверочных точек клеточного цикла. Таковы Chkl, Chk2. Данный комплекс белков контролирует завершенность событий, имеющих место в каждой фазе, и останавливает клеточный цикл, если возникают какие-либо нарушения, например, разрыв нитей ДНК. Наиболее изучены три сверочные точки контроля (checkpoints), отвечающих кратким периодам клеточного цикла, когда клетки наиболее чувствительны к возможным повреждениям. Эти чувствительные периоды выявлены в конце фаз G,, G2H M (Cooper, 2000). Большинство нарушений клеточного цикла, сопряженных с раковыми заболеваниями, приходится на Gj-фазу и G/S-переход (Malumbres, Camero, 2003). Поэтому здесь мы рассмотрим лишь эту стадию клеточного цикла.
Эффекторную функцию несут уже упоминавшиеся комплексы цик-линов с циклин-зависимыми киназами, которые фосфорилируют различные низовые белки. Другим важным комплексом эффекторов являются тирозинпротеин фосфатазы Cdc25(A,B,C). Они осуществляют дефосфорилирование белков. Так, Cdc25A активирует Cdk2/CycA-комплекс при переходе G, -> S. При разрывах ДНК киназа Chk2 фос-форилирует Cdc25A и тем самым метит его для убиквитин-зависимо-го разложения. Соответственно переход G, —> S приостанавливается (Abraham, 2001). Транскрипционные факторы являются третьей категорией белков с эффекторными функциями. Ключевым элементом, контролирующим прохождение фазы G,, является транскрипционный фактор р53 (см. Malumbres, Carnero, 2003; Чумаков, 2007), образующий тетрамер и получивший название «сторожа» генома (care taker), функционирующего в роли последнего бастиона в системе защиты организма от рака (Ридли, 2008). Контрольные функции этого белка связаны с тестированием состояния нитей ДНК, в первую очередь на наличие разрывов. Если ДНК имеет разрывы, то увеличивается уровень р53 и приостанавливается переход из Gj в S-фазу Конкретно р53 активирует транскрипцию гена р21, кодирующего ингибиторы циклинзависимых киназ (Cdk), например, р16 и р18 из тк4-семейства. Одновременно в зависимости от условий р53 индуцирует процесс апоптоза (через рецепторы Fas/Apol) или антиан-гиогенеза (через TSP1/GD-AIF — ингибиторы ангиогенеза, т.е. процессов образования кровеносных сосудов), или включает гены, кодирующие репарационные белки (р48, GADD45), белки, изменяющие клеточный редокс-потенциал (Pig3), про- и анти-апоптозные белки (соответственно Вах, Вс12) в митохондриях. Если разрывов нет или они ликвидированы, то уровень р53 падает. Соответственно повышается уровень активных киназных комплексов Cdk4,6/CycD, которые фосфорилируют белок Rb (pRb). Фосфобелок Rb, обладающий неспецифической ДНК-связывающей активностью, является важным репрессором транскрипции, действующим через механизмы связывания и, как результат, инактивации (1) транскрипционного фактора E2F, (2) гистон-деацетилазы (HDAC) и (3) хроматин-ремодулирующего комплекса. Неполное фосфорилирование белка Rb (с помощью Cdk4,6) ведет к отсоединению от комплекса HDAC, которая через ряд белков способна запустить экспрессию генов, кодирующих циклины Е-типа. Эти циклины комплексируются с Cdk2-ra-назой, которая дополнительно фосфорилирует pRb по нефосфорили-рованным остаткам. pRb при его полном фосфорилировании отсоединяется от транскрипционного фактора E2F 1(2,3) который включает каскад примерно из 30 генов S-фазы, что и будет свидетельствовать о завершении G,/S-nepexofla. Выключение генов клеточного цикла в результате мутации ведет к неограниченному размножению клеток. Примером может служить ген Rb. Различные формы карциномы часто сопряжены с амплификацией CCND1-гена, кодирующего циклин D1. В культивируемых клетках саркомы с мутантным геном Rb белок Rb не образуется. Как результат, E2F находится постоянно в активном состоянии, а сам клеточный цикл уже мало зависит от регулирующего действия факторов роста. Rb может быть также мишенью онкогенных белков из опухолеродных ДНК-содержащих вирусов, таких как SV-40 (simian virus 40), аденовирусы, папиломавирусы человека. Эти белки инактивируют Rb, и тем способствуют тому же эффекту длительной транскрипционной неактивности Rb и нерегулируемому размножению клеток. В упрощенном виде клеточный цикл и, как результат, процессы деления клеток находятся под контролем трех групп генов — (1) про-тоонкогенов, индуцирующих процессы размножения клеток, (2) ге-нов-супрессоров опухолей, подавляющих процессы роста, и (3) генов, участвующих в восстановлении (репарации) поврежденных ДНК (Клаг, Каммингс, 2006). Гены последней категории часто объединяют с генами второй категории.
Протоонкогены
Протоонкогены представляют собой нормальные гены, несущие последовательности, которые гомологичны онкогенам вирусов. Онкогенами называют специфические гены вирусов, вызывающие раковое перерождение клеток. Мутантные формы протоонкогенов способны также индуцировать рак и поэтому они являются онкогенами. Таким образом, здоровая форма гена называется протоонкогеном, мутантная — онкогеном. Причиной многих форм рака у животных и человека являются РНК-содержащие вирусы (ретровирусы), которые для синтеза ДНК используют обратную транскриптазу. Большинство ретровирусов содержат лишь три гена: gag, кодирующий протеазу и структурные вирусные белки, pol, кодирующий интегразу и обратную транскриптазу, env, участвующий в образовании вирусной оболочки (Weiss, 2001; Попов, 2008). Геномы ряда ретровирусов включают дополнительные последовательности. Так, вирус саркомы Рауса (RSV) способен трансформировать эмбриональные фибробласты цыпленка в раковые. Близкий птичий вирус лейкоза (ALV —avian leukosis virus), относящийся к тому же роду Alpharetrovirus, может размножаться в тех же клетках, но не вызывает их злокачественного перерождения. Сравнение соответствующих провирусов (рис. 9.6) показывает присутствие в RSV особой src-последовательности, которая, таким образом и отвечает за злокачественное перерождение клеток, src-последо-вательность кодирует протеинтирозин-киназу (Cooper, 2000). Клетка вырабатывает много белков, содержащих тирозин-киназ-ный домен. Отметим важные мембранные рецепторы, такие как PDGFR, NGFR, лигандами для которых являются различные факторы роста, инсулиновый рецептор. У этих рецепторов внутриклеточный С-терминальный хвост несет тирозин-киназный домен. Некоторые рецепторы не имеют встроенных киназных доменов. Но они могут соединяться с тизозин-киназными белками (Krause, Etten, 2005). В качестве примера можно указать на цитокиновые рецепторы. Многие из тизозин-киназных белков, комплексирующихся с цитокиновыми рецепторами, как раз и принадлежат к семейству Src. При заражении вирусом саркомы Рауса образуется избыток вирусных Src-белков, которые будут поддерживать постоянную высокую активность цитоки-новых рецепторов. Клеточные src-гены, кодирующие тирозин-кина-зы, находятся под жестким регуляторным контролем и в норме не ведут к раковому перерождению клеток. Ген akt. Этот ген кодирует Akt-киназу, которая в неактивном состоянии связана с фосфатидилинозит (3,4,5)-трифосфатом (ФИФ3 — Р1Р3)-ФИФ3 является фосфорилированным производным ФИ(3,4)-дифосфата (ФИФ2). Фосфорилирование осуществляет особая фосфатидилинозит-киназа (ФИЗ-К — PI3-K), которая сама может быть активирована сигналами, опосредуемыми ЗТМ-рецепторами или рецепторами с тирозин-киназным внутриклеточным доменом (например, инсули-новым рецептором). Akt-киназа активируется и теряет связь с ФИФ3 после ее фосфорилирования с помощью другой киназы PDK, также связанной с ФИФ3 . В цитоплазме Akt-киназа фосфорилиру-ет различные белки. Один из них — проапоптозный белок BAD, фос-форилируемый по Serl36. Нефосфорилированный белок BAD связывает важный комплекс Bcl-2/Bcl-X, который в активном (несвязанном) состоянии ингибирует процесс апоптоза. Таким образом, Akt-киназа, фосфорилируя BAD, может остановить процесс апоптоза. Показано, что Akt-киназа может фосфорилировать и ингибировать протеазу Caspase-9 (у человека), связанную с инициацией апоптоза. В норме эта каспаза является ключевым членом сигнального пути, описываемого следующей упрощенной схемой: рецептор клеточной смерти Fas' передает сигнал на Caspase-8, которая разрезает регуля-торный белок Bid (из семейства Вс1-2), в результате чего тот перемещается в митохондрии и индуцируют выброс из них цитохрома с; последний необходим для активации адаптерного белка Apaf-1, который связывает две молекулы Caspase-9; те саморазрезаются и в таком усеченном виде способны действовать как протеазы для других белков.Транскрипционный фактор FKHR из forkhead-семейства в цитоплазме в фосфорилированном (через Akt-киназу) состоянии связан с белками семейства 14-3-3 и является неактивным. Белок PTEN (о нем дальше) способен дефосфорилировать FKHR и разрушить комплекс; освобожденный FKHR поступает в ядро и включает там транскрипцию ряда генов, в том числе гена Fas ligand (FasL), кодирующего проапоптозный белок, являющийся лигандом рецептора Fas. Здесь мы имеем пример еще одного сигнального пути с участием Akt-киназы, отрицательно регулирующего процесс апоптоза. В дополнение к этому Akt-киназа может положительно влиять на транскрипцию противоапоптозных генов через активацию нейронного фактора каппа В (NF-кВ). Этот транскрипционный фактор локализован в цитоплазме, где он образует комплекс с белком 1кВ. Akt фос-форилирует 1кВ-киназу, которая разрушает комплекс, освобождая NF-кВ. Последний перемещается в ядро, включая гены, повышающие сопротивляемость клеток к неблагоприятным факторам. Другой мишенью Akt-киназы является mTOR(mammalian target of гаратуст)-киназа, играющая ключевую роль в росте и размножении клеток через фосфорилирование протеинкиназы SGK и дополнительное фосфорилирование Akt-киназы (Hong et al, 2008; Toker, 2008). Обе киназы фосфорилируют белок р27к|р, который в активном состоянии остается в цитоплазме и, таким образом, не способен ингибировать циклин-зависимые киназы Cdk4,6 и Cdk2. Эти киназы контролируют переход клетки из фазы G, в фазу S (см. раздел 9.3.1). Ингибиторы Akt-киназы индуцируют экспрессию р27, возможно, на поздних стадиях G, и в S-фазе клеточного цикла (Gaurisankar, Stacey, 2004). Убик-витин лигаза Mdm2 (mouse double minute 2), представляющая также онкобелок, блокирует в ядре транскрипционную активность р53. Условием поступления Mdm2 в ядро является его фосфорилирование по сериновым остаткам 166 и 186, которое осуществляется Akt-киназой. Мутация, затрагивающая сайты фосфорилирования Mdm2, ведет к тому, что этот онкобелок не поступает в ядро и не подавляет активность р53. Фосфорилированная лигаза Mdm2 образует в ядре комплекс с р53, связываясь с теми сайтами этого транскрипционного фактора, которые важны для его соединения с ДНК. Одновременно Mdm2 метит р53 для его последующего разрушения и перемещает его из ядра в цитоплазму (Bose, Ghosh, 2007). Одной из мишеней р53 является ген Mdm2. Здесь, следовательно, мы имеем пример петли обратной связи. Благодаря Akt и Mdm2 уровень р53 поддерживается в нормальных клетках на низком уровне. При повреждении ДНК АТМ-киназа (о ней дальше) особым образом фосфорилирует р53, в результате чего становится невозможной образование комплекса р53 + Mdm2. Как результат, р53, по меткому выражению, страж генома (guardian of the genome — Vogelstein et al., 2000), включает экспрессию генов репарации, а в случае сильного повреждения индуцирует процесс апоптоза через Fas-рецептор. Низкий уровень апоптозной активности, связанный, в частности, с мутациями в гене р53, сопряжен с раком. С другой стороны избыточный уровень апоптозной активности данного типа связан с ревматоидным артритом. Отметим, что одной из транскрипционных мишеней р53 является ген р21. Akt-киназа может фосфорилировать р21 по треонину 145 и тем самым, как и в случае с р27, блокировать активность этого ингибитора циклин-зависимых киназ в ядре. В нервных клетках Akt-киназа активирует различные транскрипционные факторы, в том числе и NGFI-A, контролирующий гены, продукты которых повышают сопротивляемость нервных клеток. Отметим также, что, киназа Akt-1 положительно действует на развитие ЕгЬВ2-индуцированного рака груди (Cheng et al., 2007). Этому типу рака, поражающему 15-20 процентов женщин, болеющих раком груди, сопутствует повышенная экспрессия рецептора ЕгЬВ-2 (также известного как HER2/neu — Human Epidermal growth factor Receptor 2). Ген ras. Этот ген кодирует мембранный Ras-белок, являющийся ключевым элементом Ras/Raf/ERK-сигнального пути. Более 30% опухолей связаны с мутантными формами Ras-белков. Ras-белок содержит 189 аминокислотных остатков. Замены аминокислот в 12 и 61 положениях ведут к тому, что белок не может изменить функциональную конформацию и из активного стать неактивным (Клаг, Каммингс, 2006). Переход от протоонкогена в онкоген определяется единичными мутациями. Через Ras/Raf/ERK-сигнальный путь опосредуется действие на клетку различных факторов роста, таких как эпидермальный (EGF) или инсулиновый (IGF) ростовые факторы. При соединении этих факторов с соответствующим рецептором (для EGF это будет рецептор ErbB с протеинтирозин-киназным внутриклеточным доменом), рецептор возбуждается и передает сигнал на Ras-белок, который взаимодействует с Raf-протеинкиназой, та в свою очередь с МЕ-киназой (МЕК), а эта последняя фосфорилирует ER-киназу (ERK) по двум остаткам — тирозину и треонину. Ингибиторы МЕ-киназы индуцируют экспрессию р27 главным образом в Gl-фазе клеточного цикла (Gauris-ankar, Stacey, 2004). ERK поступает в ядро и фосфорилирует фактор Elkl, который в комплексе с SRF (serum response factor) включает транскрипцию ранних генов, таких, как/as. Отметим, что в данном сигнальном каскаде, кроме ras, протоонкогенами являются erbB и/а?. В некоторых случаях между рецептором и Ras вклиниваются дополнительные белки. Другой мишенью Ras/Raf/ERK-каскада является ки-наза р90 RSK2 (ribosomal S6 kinase 90 kD polypeptide 2), которая после фосфорилирования может взаимодействовать с CREB, фосфорилируя этот фактор по зег133-остатку Мутация в гене, кодирующем эту кина-зу, сопряжена с синдромом Коффина-Лоури. Ras-белок является ключевым элементом еще двух близких сигнальных каскадов (МАРК р38 и JNK/SAPK), развертывающихся при действии на клетку различных стрессоров. Второй из этих каскадов фосфорилирует белок Jun, который комплексируется с продуктом про-тоонкогена/оу, образуя транскрипционный фактор АР-1. АР-1 способен блокировать действие факторов р21 и р53.
