Транскрипционные факторы семейства CREB
Эти факторы имеют особое значение. Они запускают работу генов, связанных с образованием новых синапсов и морфологической модификацией уже существующих. Эти факторы не являются специфичными для нейронов; они найдены во многих типах клеток, в которых контролируют клеточное деление и дифференциацию. В нервных клетках их работа регулируется через эпигенетические механизмы формирования паттерна молчащих (заглушённых) и активных генов. В нейронах CREB запускает экспрессию так называемых ранних генов (immediate-early genes — Анохин К.В. в: Александров, 2006), которые кодируют факторы роста, рецепторы (например, EAARs — excitatory amino acid receptors: под этим названием объединяют возбуждающие рецепторы, такие как глутаматные, как ионотропные, так и метаборопные, рецепторы для активных стимулирующих и токсичных веществ), а также транскрипционные факторы следующего уровня: Egr-1 (другие названия: zif268, NGFI-A), участвующий в реконсолидации памяти, c-fos и c-jun (эти два образуют транскриционный димер АР-1 (activator protein 1), который запускает транскрипцию некоторых факторов роста), с-тус. Последний активирует гены известных мито-генных сигнальных молекул Wnt, Shh, EGF и ряда других (о них см. Шаталкин; 2003). Arc-ген (activity-regulated су to skeletal-related gene) контролирует процессы сборки цитоскелета. Двухголовые транскрипционные факторы семейства FOXO (в частности, FKHR и собственно FOXO) регулируют процессы нейрогене-за через активацию генов, кодирующих нейротрофин BDNF (Brain-derived neurotrophic factor), nNOS (Nitric oxide synthase). Для перестраивающихся нейронов важную роль будут играть гены, повышающие сопротивляемость клеток к действию обычных факторов и стресса. В первом случае активируется фактор NGFI-A (Nerve growth factor-inducible gene А), во втором факторы SRF (Serum response factor) и NK-кВ (Nuclear factor kappa В), включающие гены для GDNF, NTF, антиапоптозного белка Bcl-2, различных оксидантов. Многие из этих белков действуют через известные сигнальные пути. Например, транскрипционный фактор NGFI-A является конечным звеном киназного каскада, запускаемого фактором роста NGF (Nerve growth factor), который соединяется с тирозин-киназным рецептором и через него активирует ФИ3(Р13)-киназу. Последняя переводит ФИФ2 в ФИФ3. На следующих этапах в работу включается Akt-киназа, которая в ядре фосфорилирует NGFI-A. Дальше мы ограничим наше изложение рассмотрением лишь транскрипционного фактора CREB. Этот транскрипционный фактор, как и многие другие, активируется через фосфорилирование. Фосфорилирование могут осуществлять многие киназы. Например, у дрозофилы это может быть протеинки-наза А (ПК-А), с которой связывается и которую активирует цАМФ. У дрозофилы многие выявленные гены «памяти», в частности уже упоминавшиеся rutabaga, dunce, radish, amnesiac прямо или опосредованно связаны с цАМФ. цАМФ является важнейшим вторичным переносчиком сигнала, запускающим через каскад промежуточных реакций гены, имеющие CRE (cAMP response element)-pe-гуляторную последовательность в соответствии со следующей схемой: цАМФ —> протеинкиназа А —> CREB —> CRE-гены. В этой схеме активная ПК-А при увеличении ее плотности в цитоплазме попадает в ядро и фосфорилирует транскрипционный фактор dCREB-2b(CRE-cвя-зывающий белок — DrosophilaCRE binding protein-2b). Последний димеризуется, связываясь со своим партнером через мотив, известный как «лейциновые застежки» (см. подробнее об этом типе транскрипционных факторов и рисунок в: Шаталкин, 2003). В этом состоянии dCREB-2b способен инициировать транскрипцию генов, необходимых для образования новых синапсов. В литературе чаще упоминается CREB-1 и его ингибитор CREB-2 из Aplysia. Активность CREB-2 связана с другим нейропередатчиком FMRF-амином, который вызывает долгосрочное торможение, при котором CREB-2 замещает CREB-1 и активирует гистон-деацетилазу (HDAC). Последняя через деацетилирование гистонов ингибирует транскрипцию. Инактивация фактора CREB-1 блокирует долгосрочную память, но не влияет на краткосрочную. У дрозофилы выявлены еще два связанные с долговременной памятью транскрипционных регулятора Adfl и Notch, отличные от CREB. Отметим, что трансмембранный белок Notch является примером рецептора с транскрипционной активностью (Greenwald, 1998). Лиган-дом для него являются также трансмембранные белки Delta, Jagged и Serrate. В активированном состоянии Notch-рецептор образует гете-родимер, который при соединении с лигандом подвергается протео-литическому расщеплению (протеазой ADAM и затем гамма-секрета-зой/прозенилином1). Цитозольная часть, называемая Supressor of Hairless (Su(H)) у дрозофилы, Lag-1 у нематоды Caenorhabditis elegans и CBF-1 у млекопитающих, попадает в ядро, в котором вместе с некоторыми другими белками регулирует транскрипцию ряда генов, в частности генов семейства Hes (Hairy-enhancer of split). Adfl кодируется геном nalyot. Заметим, что инактивация транскрипционных факторов CREB, Adfl и Notch блокирует образование долгосрочной памяти, но не влияет на долгосрочную память, нечувствительную к анестезии. Последняя, как было уже сказано, блокируется мутацией radish (Margulies et al., 2005). Adfl является многоролевым транскрипционным фактором myb-семейства. Как и большинство членов семейства, он координирует конечные стадии клеточной дифференциации. В нейронах он участвует в образовании синапсов, что было показано на ней-ромышечных синапсах (DeZazzo et al., 2000), которые легче изучать. По своему действию он, однако, отличается от dCREB-2b, который более влияет на синаптическую функцию (проводимость), тогда как Adfl на синаптическую структуру (в частности, на рост, опосредуемый через активацию гена fascilin II). Наконец, у нематоды Caenorhabditis elegans с памятью связан кальциевый сенсор NCS-1 (neuron-specific calcium sensor 1). Формирование новых синапсов, как уже было сказано, сопряжено с образованием дендритных спинул, в концевой части которых образуется постсинаптическое уплотнение (PSD — postsynaptic density), содержащее большое число плотно упакованных рецепторов, каналов, сигнальных молекул. Форма спинул, отвечающих долгосрочной памяти, также стабилизируется на длительное время (Kasai et al., 2003) и определяется взаимодействием спинул с глиальными клетками, в первую очередь астроцитами. Взаимодействие осуществляется с помощью ЕрЬА4-рецептора (в мембране спинулы) и его лиганда эфрина A3 (Ephrin A3), связанного с мембраной астроцита (Thompson, 2003). Эфриновые лиганды А-типа заякориваются во внешнем слое мембраны посредством GPI (гликозилфосфатидилинозита). Ephrin/Eph-сигналь-ный путь контролирует аксональный паттерн (в основном через функцию отталкивания). Другая важная функция астроцитов связана с удалением из синаптической щели нейропередатчика (в основном глута-мата) через мембранные транспортеры (Fields, Stevens-Graham, 2002). Образованию новых синапсов, возможно, также содействует процесс «растекания» (spillover — Rusakov, Kullmann, 1998) нейропере-датчиков из синаптической щели, которые активируют внесинапти-ческие участки постсинаптического нейрона. Растекание, например глутамата, может активировать метаботропные mGlu-рецепторы, располагающиеся по периферии и вне синаптической щели вокруг собранных по центру NMDA-каналов (Hermans, Challiss, 2001). mGlu может передавать сигнал через G-белок на фосфолипазу С. mGlu как-то участвуют в формировании длительной памяти, но точные механизмы пока не ясны. Растекание нейропередатчиков не есть их свободная диффузия, но упорядоченное и регулируемое протеогликанами матрикса перемещение активных веществ в нужное место. Активация внесинаптического нейролигина может индуцировать образование нового синапса. Таким путем, скорее всего, и образуется ансамбль сопряженно работающих синапсов. Функциональная роль матрикса в жизни клеток — это особая тема, на которой мы не будем здесь останавливаться. В дополнение к этому относительно медленному процессу создания новых синапсов происходит более быстрая по времени активация молчащих синапсов (Kim et al., 2003; Bailey et al., 2004). Образование новых и активация молчащих синапсов так или иначе связаны с реорганизацией цитоскелета, в первую очередь актиновой сети. Показано, что препараты, тормозящие образование актиновых нитей, одновременно блокируют долгосрочную память. Реорганизация актина осуществляется при посредничестве Rho ГТФаз из одноименного семейства. В клетке они активируются интегринами, когда те получают необходимый сигнал из внеклеточного матрикса. Токсин В, являющийся ингибитором Rho-ГТФаз, также блокирует долгосрочную память. Другая малая ГТФаза из того же семейства Cdc-42 регулирует полимеризацию новых актиновых нитей, в частности, в филоподиях. Последние начинают появляться и расти у соседних нейронов при образовании ими синапса, и этот процесс сопряжен со становлением долгосрочной памяти. Поэтому Cdc-42 также является ключевым элементом клеточных структур памяти. Растения и D. discoideum имеют лишь Rac-ГТФазу. У грибов (S. cerevisiae и Sch. pombe) она отсутствует, тогда как Cdc42- и Rho-ГТФазы имеются и значимы в поляризации клеток (Etienne-Manneville, Hall, 2002). Таким образом, эволюция животных связана с развитием нового типа структурной памяти через образование индуцированных сигналами внешней среды новых синапсов, сети мембранных рецепторов, их линкерных внеклеточных и внутриклеточных белков. Мембранный рецепторный аппарат является необходимым условием становления этого нового механизма памяти. Соответственно растения и грибы имели ограниченные возможности формирования такого аппарата памяти.
Опосредованная через CREB транскрипция синаптических белков хотя и необходима для инициации долгосрочной памяти, но недостаточна для ее сохранения в течение более или менее продолжительного срока (более суток). Каким образом поддерживается молекулярная
машина, лежащая в основе долгосрочной памяти, учитывая небольшой срок жизни молекул (от часов до дней) в сравнении с памятью (годы)? Многие размножающиеся клетки содержат запас неактивных, покоящихся мРНК-транскриптов, отличающихся короткими полиадени-ловыми хвостами из 20-40 нуклеотидов. Полиадениловые хвосты представляют собой концевую модификацию З'-конца мРНК, образованную последовательностью аденозин-5'-монофосфата. Трансляция таких неактивных мРНК возможна после удлинения их полиаденило-вых хвостов до 200-250 нуклеотидов. Процесс удлинения хвостов контролируется небольшим фрагментом в нетранслируемой области З'-конца. Этот фрагмент имеет характерную последовательность UUUUUAU и его называют элементом цитоплазматического полиаденилирования (cytoplasmic golyadenylation element — CPE). В свою очередь активность этой последовательности зависит от связывания ее с цитоплаз-матическим белком СРЕВ (CPE binding protein: не путать с ранее упомянутым белком CREB). СРЕВ впервые был выделен из ооцитов шпорцевой лягушки (Xenopus) в качестве трансляционного регулятора с двойной функцией — активации и репрессии, определяемых через фосфорилирование. Фосфорилирование осуществляет протеинкина-за Aurora. В ооцитах Xenopus специфический класс материнских мРНК имеет укороченные полиадениловые хвосты. Удлинение полиадени-ловых хвостов этих неактивных мРНК как раз и зависит от связывания СРЕВ с CPE-последовательностью. В неактивном состоянии СРЕВ входит ключевым элементом в белковый комплекс, включающий также платформенный белок симплектин, специфический фактор CPSF (cleavage and polyadenylation specifity factor), который опознает последовательность AAUAAA и определяет (совместно с СРЕВ) рабочее положение поли(А)нуклеазы PARN и поли(А)полимеразы Gld2 ниже этой последовательности. Фосфорилирование СРЕВ (с помощью Aurora) ведет к удалению из комплекса PARN. Как результат создаются условия для работы поли(А)полимеразы, которая достраивает полиадениловый хвост до нужной длины. В неактивном состоянии СРЕВ может также комплексироваться через белок Maskin с фактором инициации трансляции eIF4E, который в соединении с Maskin не показывает трансляционной активности. Фосфорилирование СРЕВ ведет к освобождению eIF4E, который комплексируется с другими белками, в том числе и с поли(А)связыва-ющим белком РАВР, удлиняющим хвост. В этом случае имеет место как удлинение полиаденилового хвоста, так и процесс трансляции (дальнейшие детали см. Klann, Dever, 2004; Richter, 2007). У нейронной изоформы СРЕВ из моллюска Aplysia нет сайтов фос-форилирования. Уровень этой изоформы в синапсах обычно низкий, но резко возрастает в результате действия серотонина. Интересная особенность СРЕВ — наличие прионовых доменов. В дрожжах увеличение уровня прионовых белков ведет к их трансформации в прионовое состояние с вырожденной конформационной структурой, отличающейся высоким уровнем упорядоченных (3-полос. Это состояние устойчиво к действию протеаз и оно может индуцировать переход от нормальной к вырожденной конформации у других гомологичных белков, с которыми оно будет последовательно соединяться с образованием нитевидных структур (амилоидов). Амилоиды могут фрагментироваться и каждый из фрагментов способен играть роль затравки при образовании новых амилоидов (Инге-Вечтомов и др., 2004; Krishnan, Lindquist, 2005; Maury, 2009). Q/N-домен из СРЕВ Aplysia (в смеси с зеленым флуоресцентным белком), введеный в клетки дрожжей, образует там три состояния, растворимое, много небольших агрегаций и несколько крупных агрегатов. Предположительно аналогичный переход СРЕВ из неактивного информационного состояния в активную прионовую конформацию может иметь место при повышении уровня этого белка под действием серотонина. В этом случае активное состояние СРЕВ будет самоподдерживаться и длительно сохраняться в клетке уже без действия серотонина по типу патогенных прионов (Si et al., 20036; Shorter, Lindquist, 2005), когда активная конформация участвует в фолдинге неактивной формы (незрелого белка) и соединяется с последней в мультимерную структуру. Во всяком случае СРЕВ из Aplysia ведет себя в дрожжах как типичный при-он. В отличие от известных прионов прионовая форма СРЕВ функциональна, являясь, в сущности, регулятором синаптического роста. Кроме СРЕВ, амилоидное функциональное состояние отмечено у более чем 60 других белков (Maury, 2009). У Е. coli известным функциональным амилоидом являются сиг/г-фибрилы, придающие устойчивость внеклеточному матриксу биопленки, с помощью которой бактерия прикрепляется к клеткам хозяина. Другим классом бактериальных амилоидов являются -фибрилы. Рассмотренная схема образования памяти — всего лишь грубая канва реальных процессов, причем не всех, а скорее некоторого фрагмента общей картины. Память столь важна для выживания животных, что она без сомнения должна дублироваться и скорее всего разными, но действующими параллельно механизмами. Есть веские основания предполагать, что какие-то элементы памяти связаны с изменением белков, в том числе мембранных, через процессы ацетилирования, гликозилирования, паль-митинирования по типу наномозга бактерий (Routtenberg, Rekart, 2005). Малые РНК составляют второй уровень регуляции внутриклеточных процессов наряду с белковым аппаратом. Поэтому не исключено, что они также как-то задействованы в процессах формирования памяти. Наряду с синаптическои активно обсуждается возможность формирования памяти через нейронную пластичность. В этом направлении пока лишь больше косвенных свидетельств. До описания механизмов и тем более построения молекулярных моделей пока дело не дошло. Но можно думать, что в основе нейронной пластичности, хотя бы частично, лежат те же процессы образования клеточных структур типа дендритных выростов, которые мы отнесли к явлению раздражимости.
Эти факторы имеют особое значение. Они запускают работу генов, связанных с образованием новых синапсов и морфологической модификацией уже существующих. Эти факторы не являются специфичными для нейронов; они найдены во многих типах клеток, в которых контролируют клеточное деление и дифференциацию. В нервных клетках их работа регулируется через эпигенетические механизмы формирования паттерна молчащих (заглушённых) и активных генов. В нейронах CREB запускает экспрессию так называемых ранних генов (immediate-early genes — Анохин К.В. в: Александров, 2006), которые кодируют факторы роста, рецепторы (например, EAARs — excitatory amino acid receptors: под этим названием объединяют возбуждающие рецепторы, такие как глутаматные, как ионотропные, так и метаборопные, рецепторы для активных стимулирующих и токсичных веществ), а также транскрипционные факторы следующего уровня: Egr-1 (другие названия: zif268, NGFI-A), участвующий в реконсолидации памяти, c-fos и c-jun (эти два образуют транскриционный димер АР-1 (activator protein 1), который запускает транскрипцию некоторых факторов роста), с-тус. Последний активирует гены известных мито-генных сигнальных молекул Wnt, Shh, EGF и ряда других (о них см. Шаталкин; 2003). Arc-ген (activity-regulated су to skeletal-related gene) контролирует процессы сборки цитоскелета. Двухголовые транскрипционные факторы семейства FOXO (в частности, FKHR и собственно FOXO) регулируют процессы нейрогене-за через активацию генов, кодирующих нейротрофин BDNF (Brain-derived neurotrophic factor), nNOS (Nitric oxide synthase). Для перестраивающихся нейронов важную роль будут играть гены, повышающие сопротивляемость клеток к действию обычных факторов и стресса. В первом случае активируется фактор NGFI-A (Nerve growth factor-inducible gene А), во втором факторы SRF (Serum response factor) и NK-кВ (Nuclear factor kappa В), включающие гены для GDNF, NTF, антиапоптозного белка Bcl-2, различных оксидантов. Многие из этих белков действуют через известные сигнальные пути. Например, транскрипционный фактор NGFI-A является конечным звеном киназного каскада, запускаемого фактором роста NGF (Nerve growth factor), который соединяется с тирозин-киназным рецептором и через него активирует ФИ3(Р13)-киназу. Последняя переводит ФИФ2 в ФИФ3. На следующих этапах в работу включается Akt-киназа, которая в ядре фосфорилирует NGFI-A. Дальше мы ограничим наше изложение рассмотрением лишь транскрипционного фактора CREB. Этот транскрипционный фактор, как и многие другие, активируется через фосфорилирование. Фосфорилирование могут осуществлять многие киназы. Например, у дрозофилы это может быть протеинки-наза А (ПК-А), с которой связывается и которую активирует цАМФ. У дрозофилы многие выявленные гены «памяти», в частности уже упоминавшиеся rutabaga, dunce, radish, amnesiac прямо или опосредованно связаны с цАМФ. цАМФ является важнейшим вторичным переносчиком сигнала, запускающим через каскад промежуточных реакций гены, имеющие CRE (cAMP response element)-pe-гуляторную последовательность в соответствии со следующей схемой: цАМФ —> протеинкиназа А —> CREB —> CRE-гены. В этой схеме активная ПК-А при увеличении ее плотности в цитоплазме попадает в ядро и фосфорилирует транскрипционный фактор dCREB-2b(CRE-cвя-зывающий белок — DrosophilaCRE binding protein-2b). Последний димеризуется, связываясь со своим партнером через мотив, известный как «лейциновые застежки» (см. подробнее об этом типе транскрипционных факторов и рисунок в: Шаталкин, 2003). В этом состоянии dCREB-2b способен инициировать транскрипцию генов, необходимых для образования новых синапсов. В литературе чаще упоминается CREB-1 и его ингибитор CREB-2 из Aplysia. Активность CREB-2 связана с другим нейропередатчиком FMRF-амином, который вызывает долгосрочное торможение, при котором CREB-2 замещает CREB-1 и активирует гистон-деацетилазу (HDAC). Последняя через деацетилирование гистонов ингибирует транскрипцию. Инактивация фактора CREB-1 блокирует долгосрочную память, но не влияет на краткосрочную. У дрозофилы выявлены еще два связанные с долговременной памятью транскрипционных регулятора Adfl и Notch, отличные от CREB. Отметим, что трансмембранный белок Notch является примером рецептора с транскрипционной активностью (Greenwald, 1998). Лиган-дом для него являются также трансмембранные белки Delta, Jagged и Serrate. В активированном состоянии Notch-рецептор образует гете-родимер, который при соединении с лигандом подвергается протео-литическому расщеплению (протеазой ADAM и затем гамма-секрета-зой/прозенилином1). Цитозольная часть, называемая Supressor of Hairless (Su(H)) у дрозофилы, Lag-1 у нематоды Caenorhabditis elegans и CBF-1 у млекопитающих, попадает в ядро, в котором вместе с некоторыми другими белками регулирует транскрипцию ряда генов, в частности генов семейства Hes (Hairy-enhancer of split). Adfl кодируется геном nalyot. Заметим, что инактивация транскрипционных факторов CREB, Adfl и Notch блокирует образование долгосрочной памяти, но не влияет на долгосрочную память, нечувствительную к анестезии. Последняя, как было уже сказано, блокируется мутацией radish (Margulies et al., 2005). Adfl является многоролевым транскрипционным фактором myb-семейства. Как и большинство членов семейства, он координирует конечные стадии клеточной дифференциации. В нейронах он участвует в образовании синапсов, что было показано на ней-ромышечных синапсах (DeZazzo et al., 2000), которые легче изучать. По своему действию он, однако, отличается от dCREB-2b, который более влияет на синаптическую функцию (проводимость), тогда как Adfl на синаптическую структуру (в частности, на рост, опосредуемый через активацию гена fascilin II). Наконец, у нематоды Caenorhabditis elegans с памятью связан кальциевый сенсор NCS-1 (neuron-specific calcium sensor 1). Формирование новых синапсов, как уже было сказано, сопряжено с образованием дендритных спинул, в концевой части которых образуется постсинаптическое уплотнение (PSD — postsynaptic density), содержащее большое число плотно упакованных рецепторов, каналов, сигнальных молекул. Форма спинул, отвечающих долгосрочной памяти, также стабилизируется на длительное время (Kasai et al., 2003) и определяется взаимодействием спинул с глиальными клетками, в первую очередь астроцитами. Взаимодействие осуществляется с помощью ЕрЬА4-рецептора (в мембране спинулы) и его лиганда эфрина A3 (Ephrin A3), связанного с мембраной астроцита (Thompson, 2003). Эфриновые лиганды А-типа заякориваются во внешнем слое мембраны посредством GPI (гликозилфосфатидилинозита). Ephrin/Eph-сигналь-ный путь контролирует аксональный паттерн (в основном через функцию отталкивания). Другая важная функция астроцитов связана с удалением из синаптической щели нейропередатчика (в основном глута-мата) через мембранные транспортеры (Fields, Stevens-Graham, 2002). Образованию новых синапсов, возможно, также содействует процесс «растекания» (spillover — Rusakov, Kullmann, 1998) нейропере-датчиков из синаптической щели, которые активируют внесинапти-ческие участки постсинаптического нейрона. Растекание, например глутамата, может активировать метаботропные mGlu-рецепторы, располагающиеся по периферии и вне синаптической щели вокруг собранных по центру NMDA-каналов (Hermans, Challiss, 2001). mGlu может передавать сигнал через G-белок на фосфолипазу С. mGlu как-то участвуют в формировании длительной памяти, но точные механизмы пока не ясны. Растекание нейропередатчиков не есть их свободная диффузия, но упорядоченное и регулируемое протеогликанами матрикса перемещение активных веществ в нужное место. Активация внесинаптического нейролигина может индуцировать образование нового синапса. Таким путем, скорее всего, и образуется ансамбль сопряженно работающих синапсов. Функциональная роль матрикса в жизни клеток — это особая тема, на которой мы не будем здесь останавливаться. В дополнение к этому относительно медленному процессу создания новых синапсов происходит более быстрая по времени активация молчащих синапсов (Kim et al., 2003; Bailey et al., 2004). Образование новых и активация молчащих синапсов так или иначе связаны с реорганизацией цитоскелета, в первую очередь актиновой сети. Показано, что препараты, тормозящие образование актиновых нитей, одновременно блокируют долгосрочную память. Реорганизация актина осуществляется при посредничестве Rho ГТФаз из одноименного семейства. В клетке они активируются интегринами, когда те получают необходимый сигнал из внеклеточного матрикса. Токсин В, являющийся ингибитором Rho-ГТФаз, также блокирует долгосрочную память. Другая малая ГТФаза из того же семейства Cdc-42 регулирует полимеризацию новых актиновых нитей, в частности, в филоподиях. Последние начинают появляться и расти у соседних нейронов при образовании ими синапса, и этот процесс сопряжен со становлением долгосрочной памяти. Поэтому Cdc-42 также является ключевым элементом клеточных структур памяти. Растения и D. discoideum имеют лишь Rac-ГТФазу. У грибов (S. cerevisiae и Sch. pombe) она отсутствует, тогда как Cdc42- и Rho-ГТФазы имеются и значимы в поляризации клеток (Etienne-Manneville, Hall, 2002). Таким образом, эволюция животных связана с развитием нового типа структурной памяти через образование индуцированных сигналами внешней среды новых синапсов, сети мембранных рецепторов, их линкерных внеклеточных и внутриклеточных белков. Мембранный рецепторный аппарат является необходимым условием становления этого нового механизма памяти. Соответственно растения и грибы имели ограниченные возможности формирования такого аппарата памяти.
Роль СРЕВ в процессах трансляции
Опосредованная через CREB транскрипция синаптических белков хотя и необходима для инициации долгосрочной памяти, но недостаточна для ее сохранения в течение более или менее продолжительного срока (более суток). Каким образом поддерживается молекулярная
машина, лежащая в основе долгосрочной памяти, учитывая небольшой срок жизни молекул (от часов до дней) в сравнении с памятью (годы)? Многие размножающиеся клетки содержат запас неактивных, покоящихся мРНК-транскриптов, отличающихся короткими полиадени-ловыми хвостами из 20-40 нуклеотидов. Полиадениловые хвосты представляют собой концевую модификацию З'-конца мРНК, образованную последовательностью аденозин-5'-монофосфата. Трансляция таких неактивных мРНК возможна после удлинения их полиаденило-вых хвостов до 200-250 нуклеотидов. Процесс удлинения хвостов контролируется небольшим фрагментом в нетранслируемой области З'-конца. Этот фрагмент имеет характерную последовательность UUUUUAU и его называют элементом цитоплазматического полиаденилирования (cytoplasmic golyadenylation element — CPE). В свою очередь активность этой последовательности зависит от связывания ее с цитоплаз-матическим белком СРЕВ (CPE binding protein: не путать с ранее упомянутым белком CREB). СРЕВ впервые был выделен из ооцитов шпорцевой лягушки (Xenopus) в качестве трансляционного регулятора с двойной функцией — активации и репрессии, определяемых через фосфорилирование. Фосфорилирование осуществляет протеинкина-за Aurora. В ооцитах Xenopus специфический класс материнских мРНК имеет укороченные полиадениловые хвосты. Удлинение полиадени-ловых хвостов этих неактивных мРНК как раз и зависит от связывания СРЕВ с CPE-последовательностью. В неактивном состоянии СРЕВ входит ключевым элементом в белковый комплекс, включающий также платформенный белок симплектин, специфический фактор CPSF (cleavage and polyadenylation specifity factor), который опознает последовательность AAUAAA и определяет (совместно с СРЕВ) рабочее положение поли(А)нуклеазы PARN и поли(А)полимеразы Gld2 ниже этой последовательности. Фосфорилирование СРЕВ (с помощью Aurora) ведет к удалению из комплекса PARN. Как результат создаются условия для работы поли(А)полимеразы, которая достраивает полиадениловый хвост до нужной длины. В неактивном состоянии СРЕВ может также комплексироваться через белок Maskin с фактором инициации трансляции eIF4E, который в соединении с Maskin не показывает трансляционной активности. Фосфорилирование СРЕВ ведет к освобождению eIF4E, который комплексируется с другими белками, в том числе и с поли(А)связыва-ющим белком РАВР, удлиняющим хвост. В этом случае имеет место как удлинение полиаденилового хвоста, так и процесс трансляции (дальнейшие детали см. Klann, Dever, 2004; Richter, 2007). У нейронной изоформы СРЕВ из моллюска Aplysia нет сайтов фос-форилирования. Уровень этой изоформы в синапсах обычно низкий, но резко возрастает в результате действия серотонина. Интересная особенность СРЕВ — наличие прионовых доменов. В дрожжах увеличение уровня прионовых белков ведет к их трансформации в прионовое состояние с вырожденной конформационной структурой, отличающейся высоким уровнем упорядоченных (3-полос. Это состояние устойчиво к действию протеаз и оно может индуцировать переход от нормальной к вырожденной конформации у других гомологичных белков, с которыми оно будет последовательно соединяться с образованием нитевидных структур (амилоидов). Амилоиды могут фрагментироваться и каждый из фрагментов способен играть роль затравки при образовании новых амилоидов (Инге-Вечтомов и др., 2004; Krishnan, Lindquist, 2005; Maury, 2009). Q/N-домен из СРЕВ Aplysia (в смеси с зеленым флуоресцентным белком), введеный в клетки дрожжей, образует там три состояния, растворимое, много небольших агрегаций и несколько крупных агрегатов. Предположительно аналогичный переход СРЕВ из неактивного информационного состояния в активную прионовую конформацию может иметь место при повышении уровня этого белка под действием серотонина. В этом случае активное состояние СРЕВ будет самоподдерживаться и длительно сохраняться в клетке уже без действия серотонина по типу патогенных прионов (Si et al., 20036; Shorter, Lindquist, 2005), когда активная конформация участвует в фолдинге неактивной формы (незрелого белка) и соединяется с последней в мультимерную структуру. Во всяком случае СРЕВ из Aplysia ведет себя в дрожжах как типичный при-он. В отличие от известных прионов прионовая форма СРЕВ функциональна, являясь, в сущности, регулятором синаптического роста. Кроме СРЕВ, амилоидное функциональное состояние отмечено у более чем 60 других белков (Maury, 2009). У Е. coli известным функциональным амилоидом являются сиг/г-фибрилы, придающие устойчивость внеклеточному матриксу биопленки, с помощью которой бактерия прикрепляется к клеткам хозяина. Другим классом бактериальных амилоидов являются -фибрилы. Рассмотренная схема образования памяти — всего лишь грубая канва реальных процессов, причем не всех, а скорее некоторого фрагмента общей картины. Память столь важна для выживания животных, что она без сомнения должна дублироваться и скорее всего разными, но действующими параллельно механизмами. Есть веские основания предполагать, что какие-то элементы памяти связаны с изменением белков, в том числе мембранных, через процессы ацетилирования, гликозилирования, паль-митинирования по типу наномозга бактерий (Routtenberg, Rekart, 2005). Малые РНК составляют второй уровень регуляции внутриклеточных процессов наряду с белковым аппаратом. Поэтому не исключено, что они также как-то задействованы в процессах формирования памяти. Наряду с синаптическои активно обсуждается возможность формирования памяти через нейронную пластичность. В этом направлении пока лишь больше косвенных свидетельств. До описания механизмов и тем более построения молекулярных моделей пока дело не дошло. Но можно думать, что в основе нейронной пластичности, хотя бы частично, лежат те же процессы образования клеточных структур типа дендритных выростов, которые мы отнесли к явлению раздражимости.
