Химическая передача сигнала в клетку связана с взаимодействием двух молекул, называемых лигандом и рецептором. Лиганд — это вещество, которое имеют сродство с рецептором, связываясь с которым оно его как-то изменяет и тем самым передает сигнал. Рецепторы можно подразделить на три категории: трансмембранные, цитоплазматические и ядерные. Две последние категории включают рецепторы, которые, в отличие от трансмембранных, свободно существуют в цитоплазме и ядре. Они могут активироваться лишь небольшими гидрофобными молекулами, которые способны диффундировать сквозь мембрану. Таковы, например, стероидные гормоны и близкие к ним по действию молекулы (витамин D3, ретиноидная кислота), секретируемые эндокринными клетками. Связанные с мембраной белки делят на интегральные и периферические (Гусев, Минеева, 1992; Cooper, 2000; Шаталкин, 2004а). Первые пронизывают всю мембрану (трансмембранные белки), либо только какой-то один липидный слой. Трансмембранная часть белка обычно организована в а-спирали, состоящие из 20-25 гидрофобных аминокислот, а-спиралей в белке может быть от одной (например, у гликофоринов эритроцита) до многих (например, эукариотические рецепторы, сопряженные с G-белками, характеризуются семью а-спиралями). Интегральные белки являются амфипатическими молекулами с гидрофильными концами, торчащими по обе стороны мембраны; аминокислотные остатки гидрофобной части взаимодействуют с жирно-кислотными «хвостами» фосфолипидов, чем обеспечивается жесткое соединение интегральных белков с мембраной.
Периферические белки находятся вне мембраны или частично погружены в нее. Для них нехарактерно гидрофобное взаимодействие с липидами, и их соединение с мембраной осуществляется через интегральные белки, либо с помощью особых якорных соединений. Один важный класс якорных молекул связан с внешним листком бислоя. Самым обычным является гликозилфосфатидилинозит (GPI-якорь). На внутреннем листке белки заякориваются с помощью миристиновой (С]4), пальмитиновой (С16) кислот или пренильного остатка (изопреноидный якорь у коферментов убихинона и менахинона, у Ras-белков).
В консолидации памяти участвует несколько сигнальных путей, которые различают по вторичным переносчикам (мессенджерам) сигнала.
1. Фосфоинозитиды. Первичным мессенджером обычно является рецептор, связанный с G-белками. От него сигнал передается на энзим фосфолипазу С-|3 (ФЛС-(3 — PLC-(3). Активированная ФЛС-(3 осуществляет гидролиз фосфатидилинозит4,5-дифосфата (ФИФ2 — Р1Р2), заякоренного во внутреннем листке мембраны, в результате чего образуются два вторичных переносчика: инозит 1,4,5-трифосфат (ИФ3 — 1Р3) уходит в цитоплазму, а в мембране остается диацилглицерин (ДАГ — DAG). Первый мессенджер является гидрофильным; он открывает Са2+-ионные каналы в кальциевых везикулах эндоплазмати-ческого ретикулума. Са2+ поддерживается в клетке на очень низком уровне (0.1 цМ). При открытии кальциевых каналов концентрация Са2+ может увеличиваться в 10 раз и более. Кальций важен для освобождения кальмодулина, образующего в пресинаптическом нейроне комлекс с кальмодулин-связывающим белком нейромодулином, в постсинап-тическом нейроне — с нейрограмином, и активации различных киназ, в частности, кальмодулин зависимой киназы СаМКП (calcium/calmo-dulin-dependent protein kinase II). СаМКП способна фосфорилировать АМРА- и NMDA-рецепторы, а также цитоплазматический фактор СРЕВ (Xia, Storm, 2005). Липофильный ДАГ непосредственно активирует кальций-зависимую протеинкиназу С (ПК-С — РК-С). Эта ки-наза непосредственно или через ряд промежуточных киназ фосфори-лирует транскрипционные факторы, которые включают транскрипцию определенных генов.
2. ФосфатидилинозитЗ,4,5-трифосфат (ФИФ3 — Р1Р3). В некоторых случаях ФИФ2 с помощью особой фосфатидилинозитЗ-киназы (ФИЗ-К—PI3-K) фосфорилируется до ФИФ3, который служит платформой для Akt-киназы, имеющей плекстриновый домен, по которому и происходит соединение. Мы уже обсуждали этот сигнальный путь в главе 9 (см. рис. 9.7). Akt-киназа отсоединяется от Р1Р3 после ее фос-форилирования другой киназой PDK. Akt-киназа способна фосфорилировать ряд цитоплазматических белков, в числе которых известны факторы трансляции (Bekinschtein et al., 2008).
3. Циклический аденозинмонофосфат (цАМФ — сАМР). Сигнальный путь с этим вторичным мессенджером начинается от рецепторов, связанных с G-белками. При прохождении через рецептор сигнала G-белки активируют аденилатциклазу, которая катализирует образование цАМФ из АТФ. цАМФ в свою очередь активирует зависимые от него киназы, например протеинкиназу А (ПК-А — РК-А). Эта киназа состоит из двух регуляторных и двух каталитических субъединиц. Связывание регуляторных субъединиц циклическим аденозинмоно-фосфатом ведет к активации и отделению каталитических субъединиц, которые при достаточно высокой концентрации поступают в ядро и фосфорилируют различные транскрипционные факторы, в том числе имеющие отношение к нашей теме белки семейства CREB (о них дальше).
4. ГТФ(ОТР)-связывающий белок Ras. Ras-белки, или малые гуа-нин-нуклеотид связывающие белки впервые были обнаружены у крысиного вируса саркомы (rat sarcoma virus). Второе название связано, во-первых, с размерами Ras-белков, которые почти в 2 раза меньше а-субъе-диницы G-белка, и, во-вторых, с комплексированием белка с гуанин-нуклеотидом (другое название: гуанин-нуклеозидфосфат, гуанозинфос-фат). Через встроенный нуклеозидфосфат осуществляется регуляция энзиматической активности белка, который неактивен при комплекси-ровании с ГДФ и активен при переходе последнего в ГТФ. Ввиду этой особенности Ras-белки функционируют аналогично а-субъединице G-белка, который, напомним, представлен гетеротримером (не мономером). Ras-белки обладают небольшой ГТФазной активностью, так что ГТФ-связанная форма белка произвольно превращается в ГДФ-связан-ную форму. Из-за этой особенности Ras-белки называют ГТФазами. Ras-белки образуют надсемейство с более чем 50 белками. Внутри надсемейства различают семейства Ras, Rab, Arf/Sar, Rho/Rac и Ran (Bischoff et al., 1999; Takai et al., 2001). Здесь мы коснемся лишь некоторых белков. Ras-семейство. Ras-ГТФазы широко распространены среди эука-риот, они известны у животных, дрожжей, но не обнаружены у растений. Они регулируют экспрессию генов и значимы в клеточных процессах размножения, дифференциации и выживаемости. Ras подобна а-субъединице G-белка. При возбуждении она взаимодействует с Raf-протеинкиназой, которая фосфорилирует МЕ-киназу (МЕК), а эта последняя в свою очередь ER-киназу (ERK) по двум ее остаткам — тирозину и треонину. ERK в ядре фосфорилирует различные белки, выполняющие роль транскрипционных факторов (т.е. специфических белков, регулирующих транскрипцию).
5. Два сигнальных каскада отвечают на стрессовые воздействия. Оба включают митоген-активируемые протеин киназы (МАРК), являющиеся ключевыми регуляторами процессов размножения, клеточного деления и дифференциации. Один из них, уже упоминавшийся JNK-сигнальный путь (JNK/SAPK — Jun N-terminal kinase/stress-activated protein kinase) индуцирует работу проапоптозных генов. Другой, МАРК р38-каскад, действует через ГТФ-связывающий белок Ras параллельно Ras/Raf/ERK-каскаду Этот каскад отвечает на действие разнообразных цитокинов, избыточное производство которых сопряжено с многими заболеваниями, такими как ревматоидный артрит, остеопороз, эндотоксичный шок и др.
Наконец, в ряде случаев важная роль принадлежит протеинкиназе С (ПК-С — РК-С). ПК-С, как и СаМКП, активируется при резком увеличении концентрации ионов Са2+. В частности, выделение глутамата пресинаптической клеткой и связывание его с АМРА-рецептором открывает последний для внутриклеточного потока ионов натрия. В результате деполяризуется постсинаптическая клетка, что в свою очередь ведет к потоку ионов Са2+ через NMDA-рецепторы. ПК-С содержит регуляторную последовательность, закрывающую каталитический домен. Эта последовательность, однако, может быть отрезана про-теазой Calpain, что приведет к постоянной активности протеинкина-зы. Последняя фосфорилирует АМРА-рецепторы, и в таком усеченном состоянии будет на долговременной основе повышать проводимость рецептора.
Действие ростовых факторов
В качестве примера можно взять важный секреторный белок нейротрофин BDNF (Brain-derived neurotrophic factor), который экспрессируется на высоком уровне в гиппокампе. Нейротрофин BDNF взаимодействует с двумя мембранными рецепторами TrkB (receptor tyrosine kinase) и p75NTR (pan-neuro-trophin receptor). Синаптические эффекты связаны лишь с TrkB. Рецепторы этого класса имеют тирозин-киназные домены во внутриклеточной части. Один рецептор, TrkB=Tl, работающий в гли-альных клетках, связан с G-белками, через которые передает сигнал на фосфолипазу С (Blum, Konnerth, 2005). Соединяясь с TrkB, лиганд BDNF индуцирует три сигнальных каскада (Reihardt, 2006; Bekinschtein et al., 2008). Один опосредуется через активацию ФИЗ-киназы (PI3-K), которая фосфорилирует ФИФ2в третьем положении инозита с образованием ФИФ3. ФИФ3 связывается через плекстриновый домен с Act-кина-зой, которая после фосфорилирования (с помощью PDK-киназы) отделяется от Р1Р3, принимая участие в процессах трансляции и ряде других. Другой механизм становления долгосрочной памяти опосредуется через Ras/Erk-каскад. Мембранный белок из малых ГТФаз приобретает активность, связываясь с ионами кальция. Значит исходно этот механизм действует через работу ионот-ропных кальциевых каналов. Кроме того, активация Ras возможна через действие различных ростовых факторов, связывающихся с ме-таботропными рецепторами, которые через внутриклеточные адаптер-ные и вспомогательные белки могут передать сигнал на Ras (см. Ша-талкин, 2003; Josselyn, Nguyen, 2005). Ras может активировать проте-инсерин/треонин-киназу Raf, если та соединяется с адаптерным белком. У дрозофилы этот белок является членом семейства 14-3-3 (Tzivion, Avruch, 2002) и кодируется геном leonardo, который высоко активен в грибовидных телах. Raf фосфорилирует и тем самым активирует вторую киназу МЕК, та МАРК и эта последняя ядерную Rsk. Активированная Rsk фосфорилирует транскрипционный фактор CREB, контролирующий гены развития. Третий каскад, ведущий к активации CREB, опосредуется через фосфолипазу С гамма (PLC-y), которая индуцирует выброс кальция из эндоплазматической сети, в результате чего активируется кальмодулин зависимая киназа СаМКП. Мы уже обсуждали этот каскад. Рецепторы ТгкВ могут непосредственно взаимодействовать с ионными каналами. Повышение уровня кальция в постсинаптическом нейроне сопряжено с повышением уровня выделения им BDNF. Параллельно увеличивается производство рецептора. Высокий уровень BDNF активирует аналогичные процессы в пре-синаптическом нейроне, которые в свою очередь усиливают эти процессы в постсинаптическом нейроне и т.д. Процесс идет по нарастающей и вызывает в соседстве с возбужденным синапсом образование новых синаптических выростов на дендрите (в виде спинулы) и аксоне (в виде ответвления). Через p75NTR активируются два важных каскада, ключевыми элементами которых являются киназа JNK (Jun N-terminal kinase), фос-форилирующая в числе других мишеней транскрипционный фактор c-Jun (включает гены апоптоза), и транскрипционный фактор NF- кВ, включающий гены, повышающие выживаемость клеток.
Долгосрочная память
Быстрая синаптическая передача
Она основывается на работе ионотропных (канальных) рецепторов, активность которых выражается в открытии и закрытии ионных каналов при распространении нервного возбуждения. Существенно, что становление памяти происходит при относительно высоком уровне возбуждения. В этом случае развертывается следующая последовательность событий, возможно, не единственная. При потенциале покоя NMDA-рецепторы постсинаптического нейрона, являющиеся главными поставщиками ионов Са2+ в нейрон, заблокированы ионами Mg2+. Эти каналы открываются при возбуждении глутаматом, но только (второе условие) при определенной поляризации постсинаптической клетки. Иными словами, NMDA-рецепторы являются одновременно лиганд- и электроуправляемыми каналами. При возбуждении пресинаптического нейрона в синаптическую щель начинает поступать глутамат. Но NMDA-каналы заблокированы. Поэтому глутамат может действовать лишь на АМРА-рецепторы, при активации которых они пропускают в клетку ионы натрия. Тем самым начинает меняться уровень поляризации по-стсинаптической клетки. При сбросе потенциала покоя с -70 мв до -40 открываются NMDA- и кальциевые VGCC-каналы. Резкое повышение уровня Са2+в нейроне ведет к активации киназ (СаМКИ, РК-С и Fyn-тирозин киназа). В невозбужденном нейроне СаМКИ связана с актином и находится вне зоны синапса. При повышении уровня Са2+ она автофосфорили-руется отделяется от актина и «диффундирует» в постсинаптическое уплотнение, где соединяется с внутриклеточным доменом NMDA-pe-цептора (Lisman et al., 2002; Colbran, Brown, 2004). За счет автофосфо-рилирования число точек соединения киназы с рецептором может увеличиваться. Одновременно СаМКП фосфорилирует АМРА-рецепто-ры, благодаря чему проводимость последних возрастает в среднем на 50%. Другая функция СаМКП связана с регулированием включения в постсинаптическую мембрану новых АМРА-рецепторов. В невозбужденном нейроне эти рецепторы находятся в мембране внутриклеточных везикул дендритов. При возбуждении NMDA везикулы с АМРА-рецерторами мигрируют в дендритные спинулы и через экзоцитоз включаются в постсинаптическую мембрану. СаМКП физически связывает NMDA- и АМРА-рецепторы, являясь таким образом ключевым элементом комплексирования этих рецепторов в мембране. С NMDA, как было сказано, киназа связана непосредственно, с АМРА — через актинин, заякоривающийся в нитях актина, в которых также заякоривается АМРА-рецептор с помощью белков SAP97 и 4. IN. Ком-плексирование рецепторов наряду с увеличением их плотности создает материальную основу (но не единственную) памяти. Аналогичным образом с помощью СаМКП осуществляется активация молчащих синапсов. Молчание синапсов определяется разными причинами. Одна из них, как показано методом иммуномечения, связана с отсутствием в постсинаптической мембране АМРА-рецепторов. Благодаря СаМКП число молчащих синапсов, достигающих иногда 50%, может снижаться, как это показано в ряде примерах, до 10% (Lisman et al., 2002). Другая причина постсинаптического молчания является результатом активности тромбоспондинов (Christopherson et al., 2005). Тромбоспондины представляют собой большие олигомерные молекулы межклеточного матрикса, выделяемые астроцитами. Они являются многофункциональными регуляторами клеточной и мат-рикс-клеточной адгезии и в этой роли важны в синаптогенезе. Еще одна важная функция СаМКИ связана с контролем за подвижностью дендритов, их ростом и образованием филоподий (Miller, Kaplan, 2003). СаМКП более важна на начальной стадии этих процессов, которые далее могут идти и без нее под контролем Ras-MEK-ERK-пути. Основной регулируемой мишенью является актин. В действующих дендритных выростах 80% актиновых нитей заменяются менее чем за минуту. Поэтому дендритные выросты очень подвижны и постоянно меняют форму. И это одна из важнейших составляющих си-наптической пластичности. Инактивация либо СаМКП, либо МЕК ведет к прекращению роста филоподий, так и самого дендрита. В этих процессах значимы также нейротрофины, являющиеся лигандами ти-розин-киназного рецептора. После соединения с лигандом рецептор активирует фосфолипазу С, которая гидролизует Р1Р2, высвобождая в цитоплазму ИФ3 (инозит-трифосфат), который в свою очередь важен для высвобождения Са2+ из внутриклеточных запасов (рис. 11.2, 11.3). Кальций через кальмодулин активирует СаМКИ и CaMKIV, а также в состоянии запустить Ras-MEK-ERK-путь. CaMKIV способна активировать транскрипционный фактор CREB (о нем дальше), который включает гены, необходимые для долговременного роста дендрита. Наконец, EphB-рецепторы, взаимодействуя с GEF-белками интерсек-тином и калирином в состоянии активировать Cdc42 и Rac соответственно, которые через Агр2/3 (см. Шаталкин, 2005) участвуют в образовании ветвящихся актиновых тяжей. Rho является функциональным антагонистом этих ГТФаз. EphA-рецептор активирует GEF-бе-лок эфексин (ephexin), который катализирует реакцию: ГТФ + Rho-ГДФ -> Rho-ГТФ + ГДФ. Rho-ГТФ через активацию киназ ROCK (Rho-associated kinase) и LIMK (киназа с LIM-доменом) действует на кофилин, который деполимеризует F-актин (Miller, Kaplan, 2003). В ряде случаях активность этих киназ ведет к втягиванию дендритных выростов и упрощению дендритного ветвления. Но в целом имеет место взаимодействие различных киназ. Так, у мышей, мутантных по LIMK1 имеет место аномальный рост дендритных спинул. Инъекция ингибиторов ROCK в латеральной амигдале ведет к нарушению долгосрочной памяти, но не краткосрочной (Lamprecht, LeDoux, 2004).
Медленная синаптическая передача
Она, как это следует из работ последних лет (Si et al., 2003а, б; Bailey et al., 2004; Shorter, Lindquist, 2005), осуществляется с помощью метаботропных (бесканальных) рецепторов. Специализированным органом памяти у мух являются грибовидные тела. В качестве лиганда постсинаптических метаботропных рецепторов действует нейропептид PICAP (pituitary adenylyl cyclase- activating polypeptide), кодируемый геном amnesiac (Burrell, Sahley, 2001). Этот нейропептид, связываясь с серпентиновым рецептором, активирует через G-белок аденилатциклазу, которая в свою очередь катализирует образование циклического аденозинмонофосфата (цАМФ — сАМР) из АТФ, являющегося вторичным информационным переносчиком (мессенджером) (см. рис. 9.3 и 11.3, а для более полной картины схемы метаболических процессов в: Кольман, Рем, 2000; Мушкамбаров, Кузнецов, 2003). Функциональным аналогом PICAP у медоносной пчелы является октопамин. У позвоночных специализированным органом памяти является гиппокамп. Эта часть лимбической системы мозга (Воронин, 1979; Александров, 2006) служит главным местом серотонинергической (т.е. вызываемой серотонином) активности. Серотонин (производное триптофана 5-гидрокситриптамин — 5-НТ) выделяется клетками шишковидной железы среднего мозга и является лигандом серпентинового 7ТМ-рецептора из семейства родопсинов. Серотонин с той же функциональной ролью известен и у других животных, в том числе у некоторых беспозвоночных, например, брюхоногого морского моллюска Aplysia. При определенном возбуждении серпентинового рецептора (7ТМ-рецептора) серотонином (октопамином, PICAP) активируется связанный с рецептором G-белок, который далее взаимодействует с адени-латциклазой, катализирующей образование цАМФ. цАМФ имеет множество функций в нервной клетке, в том числе является ключевым элементом развития краткосрочной и долгосрочной памяти. Первая возникает при относительно низком уровне цАМФ и опосредуется через разные механизмы, но чаще всего через МАП-киназ-ный (МАРК — Mitogen-activated protein kinase) путь. Долгосрочная память также может опосредоваться через МАРК, но индуцируется она при более сильных или более продолжительных по действию обычных раздражителей. Например, в случае Aplysia пять последовательных раздражений хвоста или пять выбросов серотонина ведут к активации МАРКр44/42 (или ERK — Extracellular signal-regulated kinase, как особый тип данного класса киназ). МАРКр44/42, попадая в ядро, фосфорилирует и тем самым активирует ряд транскрипционных факторов, в том числе Elk-1 и CREB. Фос-форилирование последнего часто осуществляется при участии про-теинкиназ А и С (ПК-А и ПК-С), которые действуют как усилители фосфорилирования. При формировании долгосрочной памяти протеинкиназа А (ПК-А — РК-А) может действовать независимо. Через серотонин и другие упомянутые лиганды метаботропных рецепторов, осуществляется медленная передача сигнала. В чем ее специфика и значение? Нейроны мозга имеют в среднем по тысяче синапсов. И если локальное синаптическое возбуждение запускает транскрипцию, то возникает серьезная проблема, как синтезируемым мРНК белков найти свой адресат, т.е. тот синапс или тот участок нейрона, который запустил транскрипцию нужных ему веществ. Метаботроп-ные рецепторы работают намного медленнее ионотропных и медленнее восстанавливаются. Поэтому они в состоянии продублировать работу ионотропного рецептора, но с определенным запаздыванием. К тому же в ответ на сигнал они параллельно запускают ряд процессов, связанных с изменением подмембранных белков, в частности полимеризацию актина. Это возбужденное состояние сохраняется еще дольше. Так, повышенный уровень F-актина (полимеризованного актина) может сохраняться после долгосрочной потенциации до пяти недель. Метаботропные рецепторы, таким образом, в состоянии длительно поддерживать возбужденное состояние, которое и будет служить меткой (адресатом) для поступающих из ядра транскриптов.
Периферические белки находятся вне мембраны или частично погружены в нее. Для них нехарактерно гидрофобное взаимодействие с липидами, и их соединение с мембраной осуществляется через интегральные белки, либо с помощью особых якорных соединений. Один важный класс якорных молекул связан с внешним листком бислоя. Самым обычным является гликозилфосфатидилинозит (GPI-якорь). На внутреннем листке белки заякориваются с помощью миристиновой (С]4), пальмитиновой (С16) кислот или пренильного остатка (изопреноидный якорь у коферментов убихинона и менахинона, у Ras-белков).
Вторичные переносчики сигналов
В консолидации памяти участвует несколько сигнальных путей, которые различают по вторичным переносчикам (мессенджерам) сигнала.
1. Фосфоинозитиды. Первичным мессенджером обычно является рецептор, связанный с G-белками. От него сигнал передается на энзим фосфолипазу С-|3 (ФЛС-(3 — PLC-(3). Активированная ФЛС-(3 осуществляет гидролиз фосфатидилинозит4,5-дифосфата (ФИФ2 — Р1Р2), заякоренного во внутреннем листке мембраны, в результате чего образуются два вторичных переносчика: инозит 1,4,5-трифосфат (ИФ3 — 1Р3) уходит в цитоплазму, а в мембране остается диацилглицерин (ДАГ — DAG). Первый мессенджер является гидрофильным; он открывает Са2+-ионные каналы в кальциевых везикулах эндоплазмати-ческого ретикулума. Са2+ поддерживается в клетке на очень низком уровне (0.1 цМ). При открытии кальциевых каналов концентрация Са2+ может увеличиваться в 10 раз и более. Кальций важен для освобождения кальмодулина, образующего в пресинаптическом нейроне комлекс с кальмодулин-связывающим белком нейромодулином, в постсинап-тическом нейроне — с нейрограмином, и активации различных киназ, в частности, кальмодулин зависимой киназы СаМКП (calcium/calmo-dulin-dependent protein kinase II). СаМКП способна фосфорилировать АМРА- и NMDA-рецепторы, а также цитоплазматический фактор СРЕВ (Xia, Storm, 2005). Липофильный ДАГ непосредственно активирует кальций-зависимую протеинкиназу С (ПК-С — РК-С). Эта ки-наза непосредственно или через ряд промежуточных киназ фосфори-лирует транскрипционные факторы, которые включают транскрипцию определенных генов.
2. ФосфатидилинозитЗ,4,5-трифосфат (ФИФ3 — Р1Р3). В некоторых случаях ФИФ2 с помощью особой фосфатидилинозитЗ-киназы (ФИЗ-К—PI3-K) фосфорилируется до ФИФ3, который служит платформой для Akt-киназы, имеющей плекстриновый домен, по которому и происходит соединение. Мы уже обсуждали этот сигнальный путь в главе 9 (см. рис. 9.7). Akt-киназа отсоединяется от Р1Р3 после ее фос-форилирования другой киназой PDK. Akt-киназа способна фосфорилировать ряд цитоплазматических белков, в числе которых известны факторы трансляции (Bekinschtein et al., 2008).
3. Циклический аденозинмонофосфат (цАМФ — сАМР). Сигнальный путь с этим вторичным мессенджером начинается от рецепторов, связанных с G-белками. При прохождении через рецептор сигнала G-белки активируют аденилатциклазу, которая катализирует образование цАМФ из АТФ. цАМФ в свою очередь активирует зависимые от него киназы, например протеинкиназу А (ПК-А — РК-А). Эта киназа состоит из двух регуляторных и двух каталитических субъединиц. Связывание регуляторных субъединиц циклическим аденозинмоно-фосфатом ведет к активации и отделению каталитических субъединиц, которые при достаточно высокой концентрации поступают в ядро и фосфорилируют различные транскрипционные факторы, в том числе имеющие отношение к нашей теме белки семейства CREB (о них дальше).
4. ГТФ(ОТР)-связывающий белок Ras. Ras-белки, или малые гуа-нин-нуклеотид связывающие белки впервые были обнаружены у крысиного вируса саркомы (rat sarcoma virus). Второе название связано, во-первых, с размерами Ras-белков, которые почти в 2 раза меньше а-субъе-диницы G-белка, и, во-вторых, с комплексированием белка с гуанин-нуклеотидом (другое название: гуанин-нуклеозидфосфат, гуанозинфос-фат). Через встроенный нуклеозидфосфат осуществляется регуляция энзиматической активности белка, который неактивен при комплекси-ровании с ГДФ и активен при переходе последнего в ГТФ. Ввиду этой особенности Ras-белки функционируют аналогично а-субъединице G-белка, который, напомним, представлен гетеротримером (не мономером). Ras-белки обладают небольшой ГТФазной активностью, так что ГТФ-связанная форма белка произвольно превращается в ГДФ-связан-ную форму. Из-за этой особенности Ras-белки называют ГТФазами. Ras-белки образуют надсемейство с более чем 50 белками. Внутри надсемейства различают семейства Ras, Rab, Arf/Sar, Rho/Rac и Ran (Bischoff et al., 1999; Takai et al., 2001). Здесь мы коснемся лишь некоторых белков. Ras-семейство. Ras-ГТФазы широко распространены среди эука-риот, они известны у животных, дрожжей, но не обнаружены у растений. Они регулируют экспрессию генов и значимы в клеточных процессах размножения, дифференциации и выживаемости. Ras подобна а-субъединице G-белка. При возбуждении она взаимодействует с Raf-протеинкиназой, которая фосфорилирует МЕ-киназу (МЕК), а эта последняя в свою очередь ER-киназу (ERK) по двум ее остаткам — тирозину и треонину. ERK в ядре фосфорилирует различные белки, выполняющие роль транскрипционных факторов (т.е. специфических белков, регулирующих транскрипцию).
5. Два сигнальных каскада отвечают на стрессовые воздействия. Оба включают митоген-активируемые протеин киназы (МАРК), являющиеся ключевыми регуляторами процессов размножения, клеточного деления и дифференциации. Один из них, уже упоминавшийся JNK-сигнальный путь (JNK/SAPK — Jun N-terminal kinase/stress-activated protein kinase) индуцирует работу проапоптозных генов. Другой, МАРК р38-каскад, действует через ГТФ-связывающий белок Ras параллельно Ras/Raf/ERK-каскаду Этот каскад отвечает на действие разнообразных цитокинов, избыточное производство которых сопряжено с многими заболеваниями, такими как ревматоидный артрит, остеопороз, эндотоксичный шок и др.
Наконец, в ряде случаев важная роль принадлежит протеинкиназе С (ПК-С — РК-С). ПК-С, как и СаМКП, активируется при резком увеличении концентрации ионов Са2+. В частности, выделение глутамата пресинаптической клеткой и связывание его с АМРА-рецептором открывает последний для внутриклеточного потока ионов натрия. В результате деполяризуется постсинаптическая клетка, что в свою очередь ведет к потоку ионов Са2+ через NMDA-рецепторы. ПК-С содержит регуляторную последовательность, закрывающую каталитический домен. Эта последовательность, однако, может быть отрезана про-теазой Calpain, что приведет к постоянной активности протеинкина-зы. Последняя фосфорилирует АМРА-рецепторы, и в таком усеченном состоянии будет на долговременной основе повышать проводимость рецептора.
Действие ростовых факторов
В качестве примера можно взять важный секреторный белок нейротрофин BDNF (Brain-derived neurotrophic factor), который экспрессируется на высоком уровне в гиппокампе. Нейротрофин BDNF взаимодействует с двумя мембранными рецепторами TrkB (receptor tyrosine kinase) и p75NTR (pan-neuro-trophin receptor). Синаптические эффекты связаны лишь с TrkB. Рецепторы этого класса имеют тирозин-киназные домены во внутриклеточной части. Один рецептор, TrkB=Tl, работающий в гли-альных клетках, связан с G-белками, через которые передает сигнал на фосфолипазу С (Blum, Konnerth, 2005). Соединяясь с TrkB, лиганд BDNF индуцирует три сигнальных каскада (Reihardt, 2006; Bekinschtein et al., 2008). Один опосредуется через активацию ФИЗ-киназы (PI3-K), которая фосфорилирует ФИФ2в третьем положении инозита с образованием ФИФ3. ФИФ3 связывается через плекстриновый домен с Act-кина-зой, которая после фосфорилирования (с помощью PDK-киназы) отделяется от Р1Р3, принимая участие в процессах трансляции и ряде других. Другой механизм становления долгосрочной памяти опосредуется через Ras/Erk-каскад. Мембранный белок из малых ГТФаз приобретает активность, связываясь с ионами кальция. Значит исходно этот механизм действует через работу ионот-ропных кальциевых каналов. Кроме того, активация Ras возможна через действие различных ростовых факторов, связывающихся с ме-таботропными рецепторами, которые через внутриклеточные адаптер-ные и вспомогательные белки могут передать сигнал на Ras (см. Ша-талкин, 2003; Josselyn, Nguyen, 2005). Ras может активировать проте-инсерин/треонин-киназу Raf, если та соединяется с адаптерным белком. У дрозофилы этот белок является членом семейства 14-3-3 (Tzivion, Avruch, 2002) и кодируется геном leonardo, который высоко активен в грибовидных телах. Raf фосфорилирует и тем самым активирует вторую киназу МЕК, та МАРК и эта последняя ядерную Rsk. Активированная Rsk фосфорилирует транскрипционный фактор CREB, контролирующий гены развития. Третий каскад, ведущий к активации CREB, опосредуется через фосфолипазу С гамма (PLC-y), которая индуцирует выброс кальция из эндоплазматической сети, в результате чего активируется кальмодулин зависимая киназа СаМКП. Мы уже обсуждали этот каскад. Рецепторы ТгкВ могут непосредственно взаимодействовать с ионными каналами. Повышение уровня кальция в постсинаптическом нейроне сопряжено с повышением уровня выделения им BDNF. Параллельно увеличивается производство рецептора. Высокий уровень BDNF активирует аналогичные процессы в пре-синаптическом нейроне, которые в свою очередь усиливают эти процессы в постсинаптическом нейроне и т.д. Процесс идет по нарастающей и вызывает в соседстве с возбужденным синапсом образование новых синаптических выростов на дендрите (в виде спинулы) и аксоне (в виде ответвления). Через p75NTR активируются два важных каскада, ключевыми элементами которых являются киназа JNK (Jun N-terminal kinase), фос-форилирующая в числе других мишеней транскрипционный фактор c-Jun (включает гены апоптоза), и транскрипционный фактор NF- кВ, включающий гены, повышающие выживаемость клеток.
Долгосрочная память
Быстрая синаптическая передача
Она основывается на работе ионотропных (канальных) рецепторов, активность которых выражается в открытии и закрытии ионных каналов при распространении нервного возбуждения. Существенно, что становление памяти происходит при относительно высоком уровне возбуждения. В этом случае развертывается следующая последовательность событий, возможно, не единственная. При потенциале покоя NMDA-рецепторы постсинаптического нейрона, являющиеся главными поставщиками ионов Са2+ в нейрон, заблокированы ионами Mg2+. Эти каналы открываются при возбуждении глутаматом, но только (второе условие) при определенной поляризации постсинаптической клетки. Иными словами, NMDA-рецепторы являются одновременно лиганд- и электроуправляемыми каналами. При возбуждении пресинаптического нейрона в синаптическую щель начинает поступать глутамат. Но NMDA-каналы заблокированы. Поэтому глутамат может действовать лишь на АМРА-рецепторы, при активации которых они пропускают в клетку ионы натрия. Тем самым начинает меняться уровень поляризации по-стсинаптической клетки. При сбросе потенциала покоя с -70 мв до -40 открываются NMDA- и кальциевые VGCC-каналы. Резкое повышение уровня Са2+в нейроне ведет к активации киназ (СаМКИ, РК-С и Fyn-тирозин киназа). В невозбужденном нейроне СаМКИ связана с актином и находится вне зоны синапса. При повышении уровня Са2+ она автофосфорили-руется отделяется от актина и «диффундирует» в постсинаптическое уплотнение, где соединяется с внутриклеточным доменом NMDA-pe-цептора (Lisman et al., 2002; Colbran, Brown, 2004). За счет автофосфо-рилирования число точек соединения киназы с рецептором может увеличиваться. Одновременно СаМКП фосфорилирует АМРА-рецепто-ры, благодаря чему проводимость последних возрастает в среднем на 50%. Другая функция СаМКП связана с регулированием включения в постсинаптическую мембрану новых АМРА-рецепторов. В невозбужденном нейроне эти рецепторы находятся в мембране внутриклеточных везикул дендритов. При возбуждении NMDA везикулы с АМРА-рецерторами мигрируют в дендритные спинулы и через экзоцитоз включаются в постсинаптическую мембрану. СаМКП физически связывает NMDA- и АМРА-рецепторы, являясь таким образом ключевым элементом комплексирования этих рецепторов в мембране. С NMDA, как было сказано, киназа связана непосредственно, с АМРА — через актинин, заякоривающийся в нитях актина, в которых также заякоривается АМРА-рецептор с помощью белков SAP97 и 4. IN. Ком-плексирование рецепторов наряду с увеличением их плотности создает материальную основу (но не единственную) памяти. Аналогичным образом с помощью СаМКП осуществляется активация молчащих синапсов. Молчание синапсов определяется разными причинами. Одна из них, как показано методом иммуномечения, связана с отсутствием в постсинаптической мембране АМРА-рецепторов. Благодаря СаМКП число молчащих синапсов, достигающих иногда 50%, может снижаться, как это показано в ряде примерах, до 10% (Lisman et al., 2002). Другая причина постсинаптического молчания является результатом активности тромбоспондинов (Christopherson et al., 2005). Тромбоспондины представляют собой большие олигомерные молекулы межклеточного матрикса, выделяемые астроцитами. Они являются многофункциональными регуляторами клеточной и мат-рикс-клеточной адгезии и в этой роли важны в синаптогенезе. Еще одна важная функция СаМКИ связана с контролем за подвижностью дендритов, их ростом и образованием филоподий (Miller, Kaplan, 2003). СаМКП более важна на начальной стадии этих процессов, которые далее могут идти и без нее под контролем Ras-MEK-ERK-пути. Основной регулируемой мишенью является актин. В действующих дендритных выростах 80% актиновых нитей заменяются менее чем за минуту. Поэтому дендритные выросты очень подвижны и постоянно меняют форму. И это одна из важнейших составляющих си-наптической пластичности. Инактивация либо СаМКП, либо МЕК ведет к прекращению роста филоподий, так и самого дендрита. В этих процессах значимы также нейротрофины, являющиеся лигандами ти-розин-киназного рецептора. После соединения с лигандом рецептор активирует фосфолипазу С, которая гидролизует Р1Р2, высвобождая в цитоплазму ИФ3 (инозит-трифосфат), который в свою очередь важен для высвобождения Са2+ из внутриклеточных запасов (рис. 11.2, 11.3). Кальций через кальмодулин активирует СаМКИ и CaMKIV, а также в состоянии запустить Ras-MEK-ERK-путь. CaMKIV способна активировать транскрипционный фактор CREB (о нем дальше), который включает гены, необходимые для долговременного роста дендрита. Наконец, EphB-рецепторы, взаимодействуя с GEF-белками интерсек-тином и калирином в состоянии активировать Cdc42 и Rac соответственно, которые через Агр2/3 (см. Шаталкин, 2005) участвуют в образовании ветвящихся актиновых тяжей. Rho является функциональным антагонистом этих ГТФаз. EphA-рецептор активирует GEF-бе-лок эфексин (ephexin), который катализирует реакцию: ГТФ + Rho-ГДФ -> Rho-ГТФ + ГДФ. Rho-ГТФ через активацию киназ ROCK (Rho-associated kinase) и LIMK (киназа с LIM-доменом) действует на кофилин, который деполимеризует F-актин (Miller, Kaplan, 2003). В ряде случаях активность этих киназ ведет к втягиванию дендритных выростов и упрощению дендритного ветвления. Но в целом имеет место взаимодействие различных киназ. Так, у мышей, мутантных по LIMK1 имеет место аномальный рост дендритных спинул. Инъекция ингибиторов ROCK в латеральной амигдале ведет к нарушению долгосрочной памяти, но не краткосрочной (Lamprecht, LeDoux, 2004).
Медленная синаптическая передача
Она, как это следует из работ последних лет (Si et al., 2003а, б; Bailey et al., 2004; Shorter, Lindquist, 2005), осуществляется с помощью метаботропных (бесканальных) рецепторов. Специализированным органом памяти у мух являются грибовидные тела. В качестве лиганда постсинаптических метаботропных рецепторов действует нейропептид PICAP (pituitary adenylyl cyclase- activating polypeptide), кодируемый геном amnesiac (Burrell, Sahley, 2001). Этот нейропептид, связываясь с серпентиновым рецептором, активирует через G-белок аденилатциклазу, которая в свою очередь катализирует образование циклического аденозинмонофосфата (цАМФ — сАМР) из АТФ, являющегося вторичным информационным переносчиком (мессенджером) (см. рис. 9.3 и 11.3, а для более полной картины схемы метаболических процессов в: Кольман, Рем, 2000; Мушкамбаров, Кузнецов, 2003). Функциональным аналогом PICAP у медоносной пчелы является октопамин. У позвоночных специализированным органом памяти является гиппокамп. Эта часть лимбической системы мозга (Воронин, 1979; Александров, 2006) служит главным местом серотонинергической (т.е. вызываемой серотонином) активности. Серотонин (производное триптофана 5-гидрокситриптамин — 5-НТ) выделяется клетками шишковидной железы среднего мозга и является лигандом серпентинового 7ТМ-рецептора из семейства родопсинов. Серотонин с той же функциональной ролью известен и у других животных, в том числе у некоторых беспозвоночных, например, брюхоногого морского моллюска Aplysia. При определенном возбуждении серпентинового рецептора (7ТМ-рецептора) серотонином (октопамином, PICAP) активируется связанный с рецептором G-белок, который далее взаимодействует с адени-латциклазой, катализирующей образование цАМФ. цАМФ имеет множество функций в нервной клетке, в том числе является ключевым элементом развития краткосрочной и долгосрочной памяти. Первая возникает при относительно низком уровне цАМФ и опосредуется через разные механизмы, но чаще всего через МАП-киназ-ный (МАРК — Mitogen-activated protein kinase) путь. Долгосрочная память также может опосредоваться через МАРК, но индуцируется она при более сильных или более продолжительных по действию обычных раздражителей. Например, в случае Aplysia пять последовательных раздражений хвоста или пять выбросов серотонина ведут к активации МАРКр44/42 (или ERK — Extracellular signal-regulated kinase, как особый тип данного класса киназ). МАРКр44/42, попадая в ядро, фосфорилирует и тем самым активирует ряд транскрипционных факторов, в том числе Elk-1 и CREB. Фос-форилирование последнего часто осуществляется при участии про-теинкиназ А и С (ПК-А и ПК-С), которые действуют как усилители фосфорилирования. При формировании долгосрочной памяти протеинкиназа А (ПК-А — РК-А) может действовать независимо. Через серотонин и другие упомянутые лиганды метаботропных рецепторов, осуществляется медленная передача сигнала. В чем ее специфика и значение? Нейроны мозга имеют в среднем по тысяче синапсов. И если локальное синаптическое возбуждение запускает транскрипцию, то возникает серьезная проблема, как синтезируемым мРНК белков найти свой адресат, т.е. тот синапс или тот участок нейрона, который запустил транскрипцию нужных ему веществ. Метаботроп-ные рецепторы работают намного медленнее ионотропных и медленнее восстанавливаются. Поэтому они в состоянии продублировать работу ионотропного рецептора, но с определенным запаздыванием. К тому же в ответ на сигнал они параллельно запускают ряд процессов, связанных с изменением подмембранных белков, в частности полимеризацию актина. Это возбужденное состояние сохраняется еще дольше. Так, повышенный уровень F-актина (полимеризованного актина) может сохраняться после долгосрочной потенциации до пяти недель. Метаботропные рецепторы, таким образом, в состоянии длительно поддерживать возбужденное состояние, которое и будет служить меткой (адресатом) для поступающих из ядра транскриптов.
