Роль индуцированного метилирования
Большое число генов, кодирующих опухолевые супрессоры, обычно инактивируются через эпигенетические механизмы, связанные с метилированием. Геном млекопитающих представляет собой метилированное образование, включающее обширные метилированные области с редкими и короткими неметилированными последовательностями ДНК. В метилированные участки входят мобильные элементы, которые становятся подвижными при снижении уровня метилированности. Гиперметилированию, индуцирующему развитие злокачественных опухолей, могут подвергаться самые разные гены, в том числе участвующие в восстановлении поврежденных последовательностей ДНК (hMLHl, BRCA1, MGMT) и регулировании клеточного цикла (р14-16), связанные с апоптозом {DAPK, APAF-1) и клеточной адгезией (CDH1, CDH3 — кодируют Е-кадерины), с гормональными ответами (RARh2). Метилирование контролирует активность ряда генов, кодирующих транскрипционные факторы (Esteller, 2008). Так, легочная аденокарцинома, связанная с потерей активности генов BRCA1 и BRCA2, обусловлена во многом гиперметилированием промоторов этих генов (Lee et al., 2007). Разные типы раковых заболеваний характеризуются своим профилем генов, подвергающихся гиперметилированию. Так, гиперметилирование генов CDHIVL RARb2 более характерно для диффузной формы рака желудка (Oue et al., 2003, 2006). У курильщиков, заболевших раком легких гиперметилированию подвергаются промоторы геновр7 6 и MGMT, а также р53 (Osada, Takahashi, 2002; Belinsky, 2004; Feng et al, 2003; Herceg, 2007). Курение, таким образом, негативно действует на ключевые пути, связанные с работой опухолевых супрессоров. Заметим, что у подростков, начавших курить до 19 лет, почти в 4 раза увеличивается риск гиперметилирования промотора RASSF1A и возникновения рака легких (Kim et al., 2003). Гиперметилирование CpG-островов ряда генов, характерное для курильщиков, сопряжено с развитием рака простаты (Enokida et al., 2006). У голландских пациентов с колоректальным раком, злоупотреблявших спиртным, отмечено гиперметилирование промоторов ряда генов, в том числе таких как АРС-1А, CDKN2D, CDKN2A, hMLHl, MGMT и RASSF1A (Engeland et al., 2003; Herceg, 2007). Профиль метилированных генов имеет и временную компоненту. Например, в развитии рака желудка метилирование генов АРС, CDH1, MGMTVLMQQT место на ранней стадии, метилирование hMLHl, RASF1A, GSTP1 — на более поздней (Kang et al., 2003). Ген RASSF1 (Ras association (RalGDS/AF-6) domain family member 1) кодирует белок, сходный с RAS-белками. Ослабление экспрессии или инактивация этого гена отмечены в патогенезе различных форм рака и обусловлены гиперметилированием CpG-островов в его промоторной области. Процессы метилирования чувствительны к ряду химических соединений, потребляемых человеком с пищей, в лечебных целях и как психотропные препараты. Так 5-азацитидин и 2'-деокси-5-азацитидин являются ингибиторами DNMT и, следовательно, ведут к гипометилированию. Напротив, ципластин и будесонид индуцируют метилирование. Многие классические канцерогены также изменяют уровень метилирования. Гипометилирование ДНК также является характерной особенностью многих форм рака. В целом рак связан с общим снижением метилированное™ генома, и выделенные уровни этого снижения могут служить хорошим маркером основных стадий развития опухоли. Мутации, вызванные разными причинами, ведут к гипометилированно-му состоянию. Поэтому нарушение репарационных механизмов имеет своей оборотной стороной гипометилирование. Гипометилирование LINE-1, SINE, Alu и IAP ретровирусных элементов (Попов, 2008) запускает процессы транспозиции, что ведет к хромосомной нестабильности, которая в свою очередь индуцирует новые нарушения геномных функций. Процесс может лавинообразно нарастать. Хромосомная нестабильность связана с активацией многих онкогенов, таких как r-ras (Ras viral oncogene homolog), MA GE\ (melanoma antigen 1), PAX1 (paired box gene 2) (Feinberg et al., 2006). Меняется также общий паттерн изменения гистоновых хвостов. В частности, в хвосте гистона Н4 имеет место деацетилирование Lys 16 и триметилирование Lys 20. В других случаях происходит метилирование Lys 9 гистона НЗ (Fraga et al., 2005). Одна из функций метилирования ДНК в нормальных клетках связана с геномным импринтингом (см. раздел 8.5.3). Потеря имприн-тинга связана с деметилированием и ведет к экспрессии импринтиро-ванного гена. Примером может служить ген Igf2, гипометилирование которого в материнской хромосоме ведет к потере импринтинга и активности гена. Активность материнского гена Igf2 отмечена в коло-ректальном раке, в опухолевых клетках рака груди, печени, мочевого пузыря. Потеря импринтинга гена Н19 характерна для клеток рака легких и толстой кишки, потеря импринтинга гена Kcnql — для клеток рака груди, печени и толстой кишки (Pogribny, Beland, 2009).
Алкоголь и курение, многие флавоноиды негативно влияют на экспрессию и активность ДНК-метилтрансфераз. Избыточное потребление алкоголя изменяет, в частности, паттерн ДНК-метилирования в клетках толстой кишки у человека и крыс. Алкоголь расщепляет фолаты, нарушает их абсорбцию и увеличивает скорость выведения из организма. Низкий уровень фолатов сопряжен с коронарными заболеваниями сердца и раком (Foley et al, 2009). Более того, хронический алкоголизм влияет на уровень мРНК DNMT в сперматозоидах и тем самым нарушает отцовский геномный импринтинг. Заметим, что алкоголь имеет и прямое действие на наследственный аппарат. Сам этанол не является карциногеном, но им является ацетальдегид, образующийся в результате окисления этанола. В геноме ацетальдегид вызывает точечные мутации. На активность Dnmt также влияют сигаретный дым и наркотики. В частности, курение ведет к деметилированию метастазных генов в раковых клетках легкого посредством ингибирования экспрессии DnmtB (Liu et al, 2007). Попутно заметим, что потребление алкоголя и курение в период беременности негативно влияют на интеллект ребенка (Липтон, 2008, с. 210). Курение матери будет иметь своим результатом увеличенный риск возникновения у ее ребенка астмы (Li et al., 2005). Эндокринные дизрупторы также меняют состояние метилированное ДНК. Тот же диэтилстилбестрол уменьшает метилированность ДНК в репродуктивных тканях и увеличивает метилированность Dnmt, что равнозначно со снижением активности этих метилтрансфераз. В частности, уменьшается метилированность онкогена c-fos. На животных показано, что фунгицид винклозолин и инсектицид метоксихлор при их попадании в организм изменяют уровни метилирования ряда генов и в результате снижают плодовитость самцов в продолжении нескольких поколений (Foley et al., 2009). Для профилактики некоторых форм рака большое значение имеет постоянное потребление свежих фруктов и зелени. Положительные данные о снижении риска заболевания получены для эндометриального рака у женщин (Yen et al., 2009), рака матки (Ghosh et al., 2008), рака поджелудочной железы (Nkondjock et al., 2005: отмечена, в частности, положительная роль томатов), рака мочевого пузыря (Tang et al., 2008: профилактическое значение имеют изотиоцианаты из свежих крестоцветных), рака легких (Wright et al., 2008).
Более 50% генов, кодирующих микроРНК, расположены в геномных областях, связанных с опухолями, или в так называемых хрупких районах, в которых имеет место повышенная частота разрывов (Zhang et al., 2007). Это косвенно свидетельствует о важной роли некодирующих РНК в канцерогенезе. Показано, в частности, что микроРНК с избыточной экспрессией могут функционировать как онкогены или опухолевые супрессоры.
Изученным примером онкогенной роли микроРНК является генный комплекс mir-17-92, кодирующий шесть микроРНК. Комплекс расположен в геномном локусе хромосомы 13q31 человека. Данный локус подвергается амплификации в раке легких и в некоторых лимфомах. Экспрессия mir-17-92 связана с активностью транскрипционного фактора с-Мус. В раковых клетках отмечена повышенная активность гена Мус и одновременно имеет место избыточная экспрессия mir-17-92. mir-17-92, следовательно, может рассматриваться как некодирующий онкоген. Транскрипционный фактор с-Мус индуцирует экспрессию фактора роста E2F1 и одновременно экспрессию комплекса mir-17-92. В то же время miR-17-5р и miR-20a из этого комплекса являются трансляционными репрессорами E2F1. Этим обеспечивается устойчивость регуляторного контура и его способность сглаживать последствия резких возмущающих воздействий. Кроме того, эти микроРНК, возможно, негативно регулируют экспрессию опухолевых суп-рессоров PTEN и RB2. Биоинформационные исследования показали, что более 600 генов могут быть мишенями miR-17-5p и miR-20a. Экспрессия Ras регулируется микроРНК let-7. В опухолевых клетках больных раком легких нормальная регуляция нарушается и устанавливается обратная зависимость между let-7, уровень которой снижается, и белком Ras, показывающим высокое содержание в клетке в сравнении с нормой. Ослабление или даже полное нарушение процессов регуляции уровня клеточных белков со стороны микроРНК является важной причиной возникновения рака. Показано, что экспрессия miR-126, miR-143 и miR-145 снижается на 80% в раковых клетках, тогда как miR-21 показывает в этих клетках почти удвоенный уровень экспрессии. В целом, однако, уровень экспрессии микроРНК существенно снижается в раковых клетках (Lu et al, 2005). В связи с этим возникает вопрос относительно роли микроРНК в канцерогенезе — являются ли изменения в их экспрессии причиной рака или они являются лишь следствием развития опухоли.
Кумар с соавт. (Kumar et al., 2007, см. также Sassen et al., 2008) показали на клеточных культурах и на Dicer-мутантных мышах, что уменьшение активности микроРНК ведет к раку. Снижение активности микроРНК в свою очередь определяется изменением уровней метилирования генов микроРНК. Так, транскрипция гена mir-124a блокируется в результате гиперметилирования его промотора во многих формах рака. Другой ген mir-127 обычно экспрессируется в нормальных клетках, но не раковых, предположительно как результат гиперметилирования промотора (Saito et al., 2006).
Исследования по некодирующим РНК и их роли в развитии раковых заболеваний только разворачиваются. Но уже сейчас ясно, что эти РНК составляют третий онкогенный фактор наряду с собственно генами и средой. Отмечена их роль в геномной нестабильности. Геномная нестабильность проявляется в точечных мутациях на нуклео-тидном уровне, а также в транслокациях, делециях, амплификациях и хромосомной анеуплоидии1 на хромосомном уровне.
9.4.3. Роль инфекций. Факторы, индуцирующие аномальное метилирование разнообразны. Выявлена большая роль инфекционных агентов (Maekita et al., 2006; Karpinski et. al., 2008). Например, в желудке ключевыми индукторами аномального метилирования являются Helicobacter pylori и вирус Эпштейна-Барра (EBV). Вирус EBV принадлежит к числу онкогенных и индуцирует клеточную трансформацию в различных типах рака (лимфома Беркитта, болезнь (лимфома) Ходжкина и др.). Сейчас известно два десятка видов эпсилон-протеобактерий рода Helicobacter, выделяемых из желудка и верхних кишок человека, кошек, собак и других млекопитающих, а также птиц. Для них характерны спиральные подвижные клетки с несколькими покрытыми жгутиками. Helicobacter pylori в последние годы отмечен как серьезный патоген, вызывающий у человека хронический гастрит и язву желудка. Я. pylori отмечен в желудке многих людей, исчисляемых миллионами. Однако, заболевает в явной форме не более 5%. У одних больных присутствие бактерий ведет к избыточному выделению G-клетками желудка гормона гастрина, который усиливает кислотность и развитие язвы. У других бактерии вызывают противоположный эффект, связанный с хроническим воспалением. Обусловленная этим низкая кислотность может быть причиной рака желудка. Иногда из В-лим-фоцитов, накапливающихся в воспаленных участках желудка, могут образовываться лимфомы, которые рассасываются при применении антибиотиков. Я. pylori выделяет особый термоустойчивый фактор, который ингибирует секрецию IL-12 в качестве иммунного ответа дендритных клеток на возбудителя. В то же время этот фактор не действует на IL-10, секретируемый дендритными клетками против Acinetobacter Iwoffi — второго возбудителя хронического гастрита, относящегося к гаммапротеобактериям семейства моракселл (Moraxellaceae). Импринтированность Igf2 в клетках плаценты мыши в период ее беременности изменяется у особей, зараженных другой эпсилонпро-теобактерией рода Campylobacter (Foley et al., 2009). Изменение кишечной флоры, сдвиг ее состава в ту или иную сторону может стать причиной развития тяжелых заболеваний, в том числе раковых. Изученным примером является Enterococcus faecalis. Род Enterococcus был установлен (в 1984 г.) для так называемых фекальных стрептококков (S. faecalis и S. faecium), которые, как оказалось, филогенетически далеки от собственно стрептококков. Е. faecalis входит в нормальную кишечную флору человека и большинства млекопитающих, но при случае может вызывать различные воспаления. При дисбалансе кишечной флоры Е. faecalis становится ключевым агентом, вызывающим кишечные колиты и развитие колоректального рака (см. Имянитов, 2005). Напротив, виды Lactobacillus в состоянии нормализировать флору и являются надежной защитой от колоректального рака (Huycke, Gaskins, 2004). Другой показательный пример — конкуренция кишечных сульфат-редуцирующих бактерий и метаногенов. Сульфатредуцирующие бактерии являются филогенетически разнородной группой форм, в названии которых имеется приставка «desulfo». Они используют сульфаты (S042~) или тиосульфата (S2032_) в качестве акцептора электронов и восстанавливают их до сероводорода H,S. Донором электронов (окисляемым субстратом) является либо водород, либо различные органические соединения, такие как ацетат, пируват, этанол, пропанол, лактат, жирные кислоты и другие. Основную массу кишечных суль-фатредукторов составляют дельтапротеобактерии (Deltaproteobacteria). Из них преобладают представители Desulfovibrio (в одном исследовании от 67 до 90%), далее идут Desulfobacter (от 9 до 16%), Desulfobulbus (от 5 до 8%). Из других сульфатредуцирующих бактерий в кишечнике человека встречаются представители Desulfotomaculum, относящиеся к грамположительным бактериям, близким к клостридиям (Huycke, Gaskins, 2004). Сульфатредукторы делятся на две группы. Одна охватывает роды Desulfobulbus, Desulfomicrobium, Desulfovibrio и другие. Представители этих родов окисляют доноры электронов не полностью, переводя их в уксусную кислоту, которую они не могут использовать. За рядом исключений эта группа отвечает порядку Десульфовибрионов (Desulfo-vibrionales). Вторая группа включает роды Desulfobacter, Desulfococcus, Desulfonema, Desulfosarcina, которые в состоянии окислять уксусную кислоту. Этой группе отвечает порядок Десульфобактерий (Desulfobac-terales). Метаногены обратили на себя внимание в связи со способностью образовывать метан. По питанию метаногены делятся на две группы, водородотрофных и метилотрофных эуриархеот. Первые (Metha-nobacterium, Methanococcus, Methanomicrobium) окисляют молекулярный водород и восстанавливают С, соединения (углекислоту, окись углерода и др.) до метана. Молекулярный водород здесь является источником как энергии, так и электронов. Поэтому метаногены существенно зависят от наличия в среде водорода, который в типичных для анаэробов местах обитания практически отсутствует. Жизнь метаногенов поддерживается за счет биогенного водорода, выделяемого при брожении различных органических материалов. Таким образом, метаногены являются одним из звеньев в цепи анаэробного разложения органики. Синтрофные отношения отмечены между водородвыделяющими бактериями рода Syntrophobacter и Methanospirillum hungateii.
Метилотрофные метаногены (например, Methanosarcina mazei) способны расщеплять метанол, метиламин и другие вещества, содержащие метиловую группу, на С02 и метан. У этих архебактерий в отличие от водородотрофных метаногенов имеются цитохромы. В кишечном тракте человека сульфатредукторы и метаногены исключают друг друга Если доминируют одни, тогда вторые либо отсутствуют, либо составляют незначительную долю. У населения развитых стран сульфатредукторы и метаногены встречаются с одинаковой частотой. В тоже время прослеживается определенная динамика замещения метаногенов, имеющих более высокий процент распространения у жителей развивающихся стран, сульфатредукторами в развитых странах, что, по-видимому, связано с большим потреблением сельскими жителями растительной пищи. Сульфатредукция связана с выделением сероводорода и как результат в среднем более частым развитием воспалительных процессов в кишечнике и колоректального рака.
Транскрипционные сети и рак
Вернемся к Akt-киназному пути. Как видно из рис. 9.7 антагонистом ФИЗ-К (фосфатидилино-зитЗ-киназы) является фосфоинозит-фосфатаза PTEN (phosphatase and tensin homologous on chromosome 10), дефосфорилизирующая ФИФ3 и переводящая ее в ФИФГ Эта фосфатаза является опухолевым суп-рессором (табл. 9.3) и занимает второе место после р53 по частоте мутирования. Наряду с akt ген, кодирующий ФИЗ-К, также является протоонкогеном. Akt-сигнальный путь, следовательно, находится под контролем опухолевого супрессора и протоонкогена (Cooper, 2000; Yin, Shen, 2008). Akt, кроме того, входит в поле действия ключевого опухолевого супрессора р53, a PTEN может взаимодействовать с онко-белком Mdm2 (Wee, Aguda, 2006; Bose, Ghosh, 2007). Наконец, вся система показывает связь с TGF-p/Smad-сигнальным каскадом (Jave-laud, Mauviel, 2006). В этом каскаде также наблюдаются антагонистические отношения между протоонкогеном с-Мус, который способен к амплификации и число копий которого может исчисляться сотнями, и опухолевыми супрессорами, представленными генами DPC и MADR2, а также генами для цитокина TGF-b (Downing, 2004; Seoane, 2006). Транскрипционный фактор c-myc активирует гены известных мито-генных сигнальных молекул Wnt, Shh, EGF и ряда других (о них см. Шаталкин, 2003). Аналогичная ситуация имеет место в известном сигнальном каскаде Hedgehog. Ген Hedgehog (hh) кодирует сигнальный белок, рецептором для которого является мембранный белок Patched (Ptc), имеющий две большие внеклеточные петли и 12 трансмембранных спиральных доменов. Этот рецептор репрессирует активность другого трансмембранного белка Smoothened (Smo), который имеет 7 трансмембранных спиралей и, следовательно, по структуре близок к рецепторам, сопряженным с G-белками (см.подробнее: Шаталкин, 2003). Лиганд Hh проявляет себя только после активации холестерином. В этом случае он связывает рецептор Ptc и тем самым снимает ингибирующее действие последнего на Smo. В результате запускается сигнальная цепь, связанная с Smo. Роль супрессора здесь играет белок Patched, тогда как ген Smoothened, кодирующий трансмембранный рецептор, является протоонкогеном (Bale, Yu, 2001). К этому надо добавить, что онкогенный статус генов не является абсолютным и может меняться в зависимости от условий. Так, тот же TGF-P показывает в здоровых эпителиальных тканях и в клетках, находящихся на ранних стадиях развития рака, антиопухолевые свойства, но становится онкогенным фактором в запущенных раковых клетках. Уже из представленных на рисунках упрощенных схем можно понять, что, сигнальные пути, определяющие движение сигнала от внешнего источника до гена мишени, не являются линейными. Их реальным представлением скорее всего будет дерево, в котором имеет место и срастание концов ветвей. Последнее означает, что экспрессия какого-то гена, индуцируемая через цепь переходов данным внешним сигналом, способна дублироваться в клетке через работу нескольких сигнальных путей, различающихся по длине, пропускной способности и скоростям прохождения сигнала. При этом возможно возбуждение других сигнальных каскадов, с которыми исходный стыкуется теми или иными своими ветвями. Таким образом, мутантные гены, вызывающие рак, входят в сложные взаимосвязанные каскады, образующие транскрипционные сети. О сложности сетей можно судить по белкам, выполняющих в сетях функцию концентраторов (хабов). Так, две киназы ATM и ATR лежат в основании огромной сети взаимодействующих белков, охватывающей более 700 названий (Matsuoka et al., 2007). Некоторые субстратные белки, связанные с ATR-киназой, который мы заимствовали из: Shiotani, Zou, 2009. Белок рЗОО, регулирующий транскрипцию и образование хроматина, имеет более 400 функциональных партнеров. Кроме упомянутых выше к числу концентраторов принадлежат белки р53, р27, Mdm2, BRCA1 и многие другие. Все они имеют неструктурированные внутренние области, благодаря чему способны взаимодействовать со многими белками. Из-за многофункциональности этих белков мутации в соответствующих генах будут вести к серьезным последствиям при нарушении регуляторных механизмов, прежде всего репарационных. Через регуляторные механизмы среда способна воздействовать на организм, не меняя сами гены. Достаточно нарушить репарационные процессы, и шлюзы, сдерживающие потоки мутаций, будут открыты.
Эволюционные перспективы
Исследования последних лет показали, что рак связан обычно с большим числом мутаций. Так опухолевые клетки спорадического рака прямой кишки содержат до 10 тысяч изменений, не наблюдаемых в здоровых клетках (Staler et al., 1999; Колотова и др., 2007). Ввиду этого считают, что естественная скорость мутирования недостаточна для превращения нормальной клетки в раковую (Loeb, 2001; Loeb et al., 2003) и что организм имеет в своем арсенале механизмы дестабилизации генома. Эти механизмы включаются в особых ситуациях, в частности, при стрессах. Мы уже говорили о скрытой генетической изменчивости, накапливаемой организмами и раскрывающейся в критических обстоятельствах. Не менее интересны хрупкие хромосомные районы. Для них характерна повышенная плотность Line- и LTR-элементов и они чувствительны к стрессам, в том числе к химическим интервенциям, например, действию афидиколина - ингибитора ДНК-полимеразы, дефицита фолиевой кислоты и т.д. Хрупкость сопряжена с более высоким уровнем разрывов и большим их разнообразием. К геномной нестабильности ведет также сверхэкспрессия ключевых для сети генов, в том числе индуцированная действием химически активных веществ. Это, в частности, показано в исследованиях на клеточных культурах для генов с-тус и H-ras (см. Колотова и др., 2007). Эти данные дают основания предположить, что среда в ее критических проявлениях способна индуцировать повышенную генетическую изменчивость. Одним из проявлений этого, возможно, и являются раковые заболевания. В.П. Щербаков (2005а,б) был прав в своем видении эволюции как способности противостоять изменениям (энтропии). Организмы все делают для того, чтобы снять или как-то ограничить мутационное давление. И на популяционном уровне это им удается. Но когда условия жизни резко ухудшаются и организмы из-за нарушений регуляторных возможностей не способны более поддерживать внутреннее равновесие (гомеостаз), то необходима новая стратегия, нацеленная на возможность быстрого приспособления. В этих условиях повышенная изменчивость будет иметь эволюционное преимущество для видов. Те виды, которые способны быстрее изменяться, имеют больше шансов занять новые свободные ниши и выжить в последующей межвидовой борьбе за занятую ими нишу. Поэтому вполне могли сформироваться механизмы, не только блокирующие регуляторные механизмы, но и запускающие процессы дестабилизации генома. С этой точки зрения раковые заболевания можно рассматривать как популяционные издержки эволюционной стратегии на максимизацию наследственных изменений как результат реакции организма на ухудшение условий его жизни.
Большое число генов, кодирующих опухолевые супрессоры, обычно инактивируются через эпигенетические механизмы, связанные с метилированием. Геном млекопитающих представляет собой метилированное образование, включающее обширные метилированные области с редкими и короткими неметилированными последовательностями ДНК. В метилированные участки входят мобильные элементы, которые становятся подвижными при снижении уровня метилированности. Гиперметилированию, индуцирующему развитие злокачественных опухолей, могут подвергаться самые разные гены, в том числе участвующие в восстановлении поврежденных последовательностей ДНК (hMLHl, BRCA1, MGMT) и регулировании клеточного цикла (р14-16), связанные с апоптозом {DAPK, APAF-1) и клеточной адгезией (CDH1, CDH3 — кодируют Е-кадерины), с гормональными ответами (RARh2). Метилирование контролирует активность ряда генов, кодирующих транскрипционные факторы (Esteller, 2008). Так, легочная аденокарцинома, связанная с потерей активности генов BRCA1 и BRCA2, обусловлена во многом гиперметилированием промоторов этих генов (Lee et al., 2007). Разные типы раковых заболеваний характеризуются своим профилем генов, подвергающихся гиперметилированию. Так, гиперметилирование генов CDHIVL RARb2 более характерно для диффузной формы рака желудка (Oue et al., 2003, 2006). У курильщиков, заболевших раком легких гиперметилированию подвергаются промоторы геновр7 6 и MGMT, а также р53 (Osada, Takahashi, 2002; Belinsky, 2004; Feng et al, 2003; Herceg, 2007). Курение, таким образом, негативно действует на ключевые пути, связанные с работой опухолевых супрессоров. Заметим, что у подростков, начавших курить до 19 лет, почти в 4 раза увеличивается риск гиперметилирования промотора RASSF1A и возникновения рака легких (Kim et al., 2003). Гиперметилирование CpG-островов ряда генов, характерное для курильщиков, сопряжено с развитием рака простаты (Enokida et al., 2006). У голландских пациентов с колоректальным раком, злоупотреблявших спиртным, отмечено гиперметилирование промоторов ряда генов, в том числе таких как АРС-1А, CDKN2D, CDKN2A, hMLHl, MGMT и RASSF1A (Engeland et al., 2003; Herceg, 2007). Профиль метилированных генов имеет и временную компоненту. Например, в развитии рака желудка метилирование генов АРС, CDH1, MGMTVLMQQT место на ранней стадии, метилирование hMLHl, RASF1A, GSTP1 — на более поздней (Kang et al., 2003). Ген RASSF1 (Ras association (RalGDS/AF-6) domain family member 1) кодирует белок, сходный с RAS-белками. Ослабление экспрессии или инактивация этого гена отмечены в патогенезе различных форм рака и обусловлены гиперметилированием CpG-островов в его промоторной области. Процессы метилирования чувствительны к ряду химических соединений, потребляемых человеком с пищей, в лечебных целях и как психотропные препараты. Так 5-азацитидин и 2'-деокси-5-азацитидин являются ингибиторами DNMT и, следовательно, ведут к гипометилированию. Напротив, ципластин и будесонид индуцируют метилирование. Многие классические канцерогены также изменяют уровень метилирования. Гипометилирование ДНК также является характерной особенностью многих форм рака. В целом рак связан с общим снижением метилированное™ генома, и выделенные уровни этого снижения могут служить хорошим маркером основных стадий развития опухоли. Мутации, вызванные разными причинами, ведут к гипометилированно-му состоянию. Поэтому нарушение репарационных механизмов имеет своей оборотной стороной гипометилирование. Гипометилирование LINE-1, SINE, Alu и IAP ретровирусных элементов (Попов, 2008) запускает процессы транспозиции, что ведет к хромосомной нестабильности, которая в свою очередь индуцирует новые нарушения геномных функций. Процесс может лавинообразно нарастать. Хромосомная нестабильность связана с активацией многих онкогенов, таких как r-ras (Ras viral oncogene homolog), MA GE\ (melanoma antigen 1), PAX1 (paired box gene 2) (Feinberg et al., 2006). Меняется также общий паттерн изменения гистоновых хвостов. В частности, в хвосте гистона Н4 имеет место деацетилирование Lys 16 и триметилирование Lys 20. В других случаях происходит метилирование Lys 9 гистона НЗ (Fraga et al., 2005). Одна из функций метилирования ДНК в нормальных клетках связана с геномным импринтингом (см. раздел 8.5.3). Потеря имприн-тинга связана с деметилированием и ведет к экспрессии импринтиро-ванного гена. Примером может служить ген Igf2, гипометилирование которого в материнской хромосоме ведет к потере импринтинга и активности гена. Активность материнского гена Igf2 отмечена в коло-ректальном раке, в опухолевых клетках рака груди, печени, мочевого пузыря. Потеря импринтинга гена Н19 характерна для клеток рака легких и толстой кишки, потеря импринтинга гена Kcnql — для клеток рака груди, печени и толстой кишки (Pogribny, Beland, 2009).
Алкоголь и курение, многие флавоноиды негативно влияют на экспрессию и активность ДНК-метилтрансфераз. Избыточное потребление алкоголя изменяет, в частности, паттерн ДНК-метилирования в клетках толстой кишки у человека и крыс. Алкоголь расщепляет фолаты, нарушает их абсорбцию и увеличивает скорость выведения из организма. Низкий уровень фолатов сопряжен с коронарными заболеваниями сердца и раком (Foley et al, 2009). Более того, хронический алкоголизм влияет на уровень мРНК DNMT в сперматозоидах и тем самым нарушает отцовский геномный импринтинг. Заметим, что алкоголь имеет и прямое действие на наследственный аппарат. Сам этанол не является карциногеном, но им является ацетальдегид, образующийся в результате окисления этанола. В геноме ацетальдегид вызывает точечные мутации. На активность Dnmt также влияют сигаретный дым и наркотики. В частности, курение ведет к деметилированию метастазных генов в раковых клетках легкого посредством ингибирования экспрессии DnmtB (Liu et al, 2007). Попутно заметим, что потребление алкоголя и курение в период беременности негативно влияют на интеллект ребенка (Липтон, 2008, с. 210). Курение матери будет иметь своим результатом увеличенный риск возникновения у ее ребенка астмы (Li et al., 2005). Эндокринные дизрупторы также меняют состояние метилированное ДНК. Тот же диэтилстилбестрол уменьшает метилированность ДНК в репродуктивных тканях и увеличивает метилированность Dnmt, что равнозначно со снижением активности этих метилтрансфераз. В частности, уменьшается метилированность онкогена c-fos. На животных показано, что фунгицид винклозолин и инсектицид метоксихлор при их попадании в организм изменяют уровни метилирования ряда генов и в результате снижают плодовитость самцов в продолжении нескольких поколений (Foley et al., 2009). Для профилактики некоторых форм рака большое значение имеет постоянное потребление свежих фруктов и зелени. Положительные данные о снижении риска заболевания получены для эндометриального рака у женщин (Yen et al., 2009), рака матки (Ghosh et al., 2008), рака поджелудочной железы (Nkondjock et al., 2005: отмечена, в частности, положительная роль томатов), рака мочевого пузыря (Tang et al., 2008: профилактическое значение имеют изотиоцианаты из свежих крестоцветных), рака легких (Wright et al., 2008).
Роль микроРНК
Более 50% генов, кодирующих микроРНК, расположены в геномных областях, связанных с опухолями, или в так называемых хрупких районах, в которых имеет место повышенная частота разрывов (Zhang et al., 2007). Это косвенно свидетельствует о важной роли некодирующих РНК в канцерогенезе. Показано, в частности, что микроРНК с избыточной экспрессией могут функционировать как онкогены или опухолевые супрессоры.
Изученным примером онкогенной роли микроРНК является генный комплекс mir-17-92, кодирующий шесть микроРНК. Комплекс расположен в геномном локусе хромосомы 13q31 человека. Данный локус подвергается амплификации в раке легких и в некоторых лимфомах. Экспрессия mir-17-92 связана с активностью транскрипционного фактора с-Мус. В раковых клетках отмечена повышенная активность гена Мус и одновременно имеет место избыточная экспрессия mir-17-92. mir-17-92, следовательно, может рассматриваться как некодирующий онкоген. Транскрипционный фактор с-Мус индуцирует экспрессию фактора роста E2F1 и одновременно экспрессию комплекса mir-17-92. В то же время miR-17-5р и miR-20a из этого комплекса являются трансляционными репрессорами E2F1. Этим обеспечивается устойчивость регуляторного контура и его способность сглаживать последствия резких возмущающих воздействий. Кроме того, эти микроРНК, возможно, негативно регулируют экспрессию опухолевых суп-рессоров PTEN и RB2. Биоинформационные исследования показали, что более 600 генов могут быть мишенями miR-17-5p и miR-20a. Экспрессия Ras регулируется микроРНК let-7. В опухолевых клетках больных раком легких нормальная регуляция нарушается и устанавливается обратная зависимость между let-7, уровень которой снижается, и белком Ras, показывающим высокое содержание в клетке в сравнении с нормой. Ослабление или даже полное нарушение процессов регуляции уровня клеточных белков со стороны микроРНК является важной причиной возникновения рака. Показано, что экспрессия miR-126, miR-143 и miR-145 снижается на 80% в раковых клетках, тогда как miR-21 показывает в этих клетках почти удвоенный уровень экспрессии. В целом, однако, уровень экспрессии микроРНК существенно снижается в раковых клетках (Lu et al, 2005). В связи с этим возникает вопрос относительно роли микроРНК в канцерогенезе — являются ли изменения в их экспрессии причиной рака или они являются лишь следствием развития опухоли.
Кумар с соавт. (Kumar et al., 2007, см. также Sassen et al., 2008) показали на клеточных культурах и на Dicer-мутантных мышах, что уменьшение активности микроРНК ведет к раку. Снижение активности микроРНК в свою очередь определяется изменением уровней метилирования генов микроРНК. Так, транскрипция гена mir-124a блокируется в результате гиперметилирования его промотора во многих формах рака. Другой ген mir-127 обычно экспрессируется в нормальных клетках, но не раковых, предположительно как результат гиперметилирования промотора (Saito et al., 2006).
Исследования по некодирующим РНК и их роли в развитии раковых заболеваний только разворачиваются. Но уже сейчас ясно, что эти РНК составляют третий онкогенный фактор наряду с собственно генами и средой. Отмечена их роль в геномной нестабильности. Геномная нестабильность проявляется в точечных мутациях на нуклео-тидном уровне, а также в транслокациях, делециях, амплификациях и хромосомной анеуплоидии1 на хромосомном уровне.
9.4.3. Роль инфекций. Факторы, индуцирующие аномальное метилирование разнообразны. Выявлена большая роль инфекционных агентов (Maekita et al., 2006; Karpinski et. al., 2008). Например, в желудке ключевыми индукторами аномального метилирования являются Helicobacter pylori и вирус Эпштейна-Барра (EBV). Вирус EBV принадлежит к числу онкогенных и индуцирует клеточную трансформацию в различных типах рака (лимфома Беркитта, болезнь (лимфома) Ходжкина и др.). Сейчас известно два десятка видов эпсилон-протеобактерий рода Helicobacter, выделяемых из желудка и верхних кишок человека, кошек, собак и других млекопитающих, а также птиц. Для них характерны спиральные подвижные клетки с несколькими покрытыми жгутиками. Helicobacter pylori в последние годы отмечен как серьезный патоген, вызывающий у человека хронический гастрит и язву желудка. Я. pylori отмечен в желудке многих людей, исчисляемых миллионами. Однако, заболевает в явной форме не более 5%. У одних больных присутствие бактерий ведет к избыточному выделению G-клетками желудка гормона гастрина, который усиливает кислотность и развитие язвы. У других бактерии вызывают противоположный эффект, связанный с хроническим воспалением. Обусловленная этим низкая кислотность может быть причиной рака желудка. Иногда из В-лим-фоцитов, накапливающихся в воспаленных участках желудка, могут образовываться лимфомы, которые рассасываются при применении антибиотиков. Я. pylori выделяет особый термоустойчивый фактор, который ингибирует секрецию IL-12 в качестве иммунного ответа дендритных клеток на возбудителя. В то же время этот фактор не действует на IL-10, секретируемый дендритными клетками против Acinetobacter Iwoffi — второго возбудителя хронического гастрита, относящегося к гаммапротеобактериям семейства моракселл (Moraxellaceae). Импринтированность Igf2 в клетках плаценты мыши в период ее беременности изменяется у особей, зараженных другой эпсилонпро-теобактерией рода Campylobacter (Foley et al., 2009). Изменение кишечной флоры, сдвиг ее состава в ту или иную сторону может стать причиной развития тяжелых заболеваний, в том числе раковых. Изученным примером является Enterococcus faecalis. Род Enterococcus был установлен (в 1984 г.) для так называемых фекальных стрептококков (S. faecalis и S. faecium), которые, как оказалось, филогенетически далеки от собственно стрептококков. Е. faecalis входит в нормальную кишечную флору человека и большинства млекопитающих, но при случае может вызывать различные воспаления. При дисбалансе кишечной флоры Е. faecalis становится ключевым агентом, вызывающим кишечные колиты и развитие колоректального рака (см. Имянитов, 2005). Напротив, виды Lactobacillus в состоянии нормализировать флору и являются надежной защитой от колоректального рака (Huycke, Gaskins, 2004). Другой показательный пример — конкуренция кишечных сульфат-редуцирующих бактерий и метаногенов. Сульфатредуцирующие бактерии являются филогенетически разнородной группой форм, в названии которых имеется приставка «desulfo». Они используют сульфаты (S042~) или тиосульфата (S2032_) в качестве акцептора электронов и восстанавливают их до сероводорода H,S. Донором электронов (окисляемым субстратом) является либо водород, либо различные органические соединения, такие как ацетат, пируват, этанол, пропанол, лактат, жирные кислоты и другие. Основную массу кишечных суль-фатредукторов составляют дельтапротеобактерии (Deltaproteobacteria). Из них преобладают представители Desulfovibrio (в одном исследовании от 67 до 90%), далее идут Desulfobacter (от 9 до 16%), Desulfobulbus (от 5 до 8%). Из других сульфатредуцирующих бактерий в кишечнике человека встречаются представители Desulfotomaculum, относящиеся к грамположительным бактериям, близким к клостридиям (Huycke, Gaskins, 2004). Сульфатредукторы делятся на две группы. Одна охватывает роды Desulfobulbus, Desulfomicrobium, Desulfovibrio и другие. Представители этих родов окисляют доноры электронов не полностью, переводя их в уксусную кислоту, которую они не могут использовать. За рядом исключений эта группа отвечает порядку Десульфовибрионов (Desulfo-vibrionales). Вторая группа включает роды Desulfobacter, Desulfococcus, Desulfonema, Desulfosarcina, которые в состоянии окислять уксусную кислоту. Этой группе отвечает порядок Десульфобактерий (Desulfobac-terales). Метаногены обратили на себя внимание в связи со способностью образовывать метан. По питанию метаногены делятся на две группы, водородотрофных и метилотрофных эуриархеот. Первые (Metha-nobacterium, Methanococcus, Methanomicrobium) окисляют молекулярный водород и восстанавливают С, соединения (углекислоту, окись углерода и др.) до метана. Молекулярный водород здесь является источником как энергии, так и электронов. Поэтому метаногены существенно зависят от наличия в среде водорода, который в типичных для анаэробов местах обитания практически отсутствует. Жизнь метаногенов поддерживается за счет биогенного водорода, выделяемого при брожении различных органических материалов. Таким образом, метаногены являются одним из звеньев в цепи анаэробного разложения органики. Синтрофные отношения отмечены между водородвыделяющими бактериями рода Syntrophobacter и Methanospirillum hungateii.
Метилотрофные метаногены (например, Methanosarcina mazei) способны расщеплять метанол, метиламин и другие вещества, содержащие метиловую группу, на С02 и метан. У этих архебактерий в отличие от водородотрофных метаногенов имеются цитохромы. В кишечном тракте человека сульфатредукторы и метаногены исключают друг друга Если доминируют одни, тогда вторые либо отсутствуют, либо составляют незначительную долю. У населения развитых стран сульфатредукторы и метаногены встречаются с одинаковой частотой. В тоже время прослеживается определенная динамика замещения метаногенов, имеющих более высокий процент распространения у жителей развивающихся стран, сульфатредукторами в развитых странах, что, по-видимому, связано с большим потреблением сельскими жителями растительной пищи. Сульфатредукция связана с выделением сероводорода и как результат в среднем более частым развитием воспалительных процессов в кишечнике и колоректального рака.
Транскрипционные сети и рак
Вернемся к Akt-киназному пути. Как видно из рис. 9.7 антагонистом ФИЗ-К (фосфатидилино-зитЗ-киназы) является фосфоинозит-фосфатаза PTEN (phosphatase and tensin homologous on chromosome 10), дефосфорилизирующая ФИФ3 и переводящая ее в ФИФГ Эта фосфатаза является опухолевым суп-рессором (табл. 9.3) и занимает второе место после р53 по частоте мутирования. Наряду с akt ген, кодирующий ФИЗ-К, также является протоонкогеном. Akt-сигнальный путь, следовательно, находится под контролем опухолевого супрессора и протоонкогена (Cooper, 2000; Yin, Shen, 2008). Akt, кроме того, входит в поле действия ключевого опухолевого супрессора р53, a PTEN может взаимодействовать с онко-белком Mdm2 (Wee, Aguda, 2006; Bose, Ghosh, 2007). Наконец, вся система показывает связь с TGF-p/Smad-сигнальным каскадом (Jave-laud, Mauviel, 2006). В этом каскаде также наблюдаются антагонистические отношения между протоонкогеном с-Мус, который способен к амплификации и число копий которого может исчисляться сотнями, и опухолевыми супрессорами, представленными генами DPC и MADR2, а также генами для цитокина TGF-b (Downing, 2004; Seoane, 2006). Транскрипционный фактор c-myc активирует гены известных мито-генных сигнальных молекул Wnt, Shh, EGF и ряда других (о них см. Шаталкин, 2003). Аналогичная ситуация имеет место в известном сигнальном каскаде Hedgehog. Ген Hedgehog (hh) кодирует сигнальный белок, рецептором для которого является мембранный белок Patched (Ptc), имеющий две большие внеклеточные петли и 12 трансмембранных спиральных доменов. Этот рецептор репрессирует активность другого трансмембранного белка Smoothened (Smo), который имеет 7 трансмембранных спиралей и, следовательно, по структуре близок к рецепторам, сопряженным с G-белками (см.подробнее: Шаталкин, 2003). Лиганд Hh проявляет себя только после активации холестерином. В этом случае он связывает рецептор Ptc и тем самым снимает ингибирующее действие последнего на Smo. В результате запускается сигнальная цепь, связанная с Smo. Роль супрессора здесь играет белок Patched, тогда как ген Smoothened, кодирующий трансмембранный рецептор, является протоонкогеном (Bale, Yu, 2001). К этому надо добавить, что онкогенный статус генов не является абсолютным и может меняться в зависимости от условий. Так, тот же TGF-P показывает в здоровых эпителиальных тканях и в клетках, находящихся на ранних стадиях развития рака, антиопухолевые свойства, но становится онкогенным фактором в запущенных раковых клетках. Уже из представленных на рисунках упрощенных схем можно понять, что, сигнальные пути, определяющие движение сигнала от внешнего источника до гена мишени, не являются линейными. Их реальным представлением скорее всего будет дерево, в котором имеет место и срастание концов ветвей. Последнее означает, что экспрессия какого-то гена, индуцируемая через цепь переходов данным внешним сигналом, способна дублироваться в клетке через работу нескольких сигнальных путей, различающихся по длине, пропускной способности и скоростям прохождения сигнала. При этом возможно возбуждение других сигнальных каскадов, с которыми исходный стыкуется теми или иными своими ветвями. Таким образом, мутантные гены, вызывающие рак, входят в сложные взаимосвязанные каскады, образующие транскрипционные сети. О сложности сетей можно судить по белкам, выполняющих в сетях функцию концентраторов (хабов). Так, две киназы ATM и ATR лежат в основании огромной сети взаимодействующих белков, охватывающей более 700 названий (Matsuoka et al., 2007). Некоторые субстратные белки, связанные с ATR-киназой, который мы заимствовали из: Shiotani, Zou, 2009. Белок рЗОО, регулирующий транскрипцию и образование хроматина, имеет более 400 функциональных партнеров. Кроме упомянутых выше к числу концентраторов принадлежат белки р53, р27, Mdm2, BRCA1 и многие другие. Все они имеют неструктурированные внутренние области, благодаря чему способны взаимодействовать со многими белками. Из-за многофункциональности этих белков мутации в соответствующих генах будут вести к серьезным последствиям при нарушении регуляторных механизмов, прежде всего репарационных. Через регуляторные механизмы среда способна воздействовать на организм, не меняя сами гены. Достаточно нарушить репарационные процессы, и шлюзы, сдерживающие потоки мутаций, будут открыты.
Эволюционные перспективы
Исследования последних лет показали, что рак связан обычно с большим числом мутаций. Так опухолевые клетки спорадического рака прямой кишки содержат до 10 тысяч изменений, не наблюдаемых в здоровых клетках (Staler et al., 1999; Колотова и др., 2007). Ввиду этого считают, что естественная скорость мутирования недостаточна для превращения нормальной клетки в раковую (Loeb, 2001; Loeb et al., 2003) и что организм имеет в своем арсенале механизмы дестабилизации генома. Эти механизмы включаются в особых ситуациях, в частности, при стрессах. Мы уже говорили о скрытой генетической изменчивости, накапливаемой организмами и раскрывающейся в критических обстоятельствах. Не менее интересны хрупкие хромосомные районы. Для них характерна повышенная плотность Line- и LTR-элементов и они чувствительны к стрессам, в том числе к химическим интервенциям, например, действию афидиколина - ингибитора ДНК-полимеразы, дефицита фолиевой кислоты и т.д. Хрупкость сопряжена с более высоким уровнем разрывов и большим их разнообразием. К геномной нестабильности ведет также сверхэкспрессия ключевых для сети генов, в том числе индуцированная действием химически активных веществ. Это, в частности, показано в исследованиях на клеточных культурах для генов с-тус и H-ras (см. Колотова и др., 2007). Эти данные дают основания предположить, что среда в ее критических проявлениях способна индуцировать повышенную генетическую изменчивость. Одним из проявлений этого, возможно, и являются раковые заболевания. В.П. Щербаков (2005а,б) был прав в своем видении эволюции как способности противостоять изменениям (энтропии). Организмы все делают для того, чтобы снять или как-то ограничить мутационное давление. И на популяционном уровне это им удается. Но когда условия жизни резко ухудшаются и организмы из-за нарушений регуляторных возможностей не способны более поддерживать внутреннее равновесие (гомеостаз), то необходима новая стратегия, нацеленная на возможность быстрого приспособления. В этих условиях повышенная изменчивость будет иметь эволюционное преимущество для видов. Те виды, которые способны быстрее изменяться, имеют больше шансов занять новые свободные ниши и выжить в последующей межвидовой борьбе за занятую ими нишу. Поэтому вполне могли сформироваться механизмы, не только блокирующие регуляторные механизмы, но и запускающие процессы дестабилизации генома. С этой точки зрения раковые заболевания можно рассматривать как популяционные издержки эволюционной стратегии на максимизацию наследственных изменений как результат реакции организма на ухудшение условий его жизни.
