Изменение метаболической активности созревающих семян и развитие устойчивости к неблагоприятным условиям
Завершение процесса созревания семян характеризуется быстрым-снижением в них содержания воды до очень низкого уровня, что-оказывает глубокое воздействие на ультраструктуру тканей семени. Потеря воды сопровождается ослаблением дыхания и снижением-синтеза белка.
Многие биохимические и цитологические изменения, сопровождающие потерю семенем воды, несомненно, являются прямым результатом пониженной доступности водной среды, в которой обычно-функционируют многие ферменты и клеточные структуры. Будет также показано, что значение некоторых изменений, протекающих в период обезвоживания, не исчерпывается их непосредственным участием в развитии жизнеспособного, зрелого, биохимически инертного семени. По мере созревания семени заметные изменения происходят и на клеточном уровне. Исследование ультраструктуры развивающихся семян таких видов, как горох Г10), Phaseolus vulgaris, Vicia faba, лимская фасоль и хлопчатник, показало, что в период накопления запасных веществ клеточные ядра, митохондрии, пластиды, эндоплазматическая сеть и диктиосомы.переходят из относительно слабо развитого состояния, в котором они находятся во время раннего эмбриогенеза, к состоянию высокой активности, которая по мере обезвоживания постепенно затухает. Эти изменения являются непосредственным проявлением изменений в состоянии клеточных мембран и, по-видимому, представляют собой активные процессы, имеющие значение для развития семени и связанные в некоторой степени с накоплением -липидов. Чтобы оценить значение обезвоживания для развития семени, необходимо выяснить, существует ли в семени, -теряющем влагу, связь между цитологическими и биохимическими изменениями. На ранних фазах развития семян клещевины и кукурузы по мере увеличения массы сухого вещества поглощение Ог возрастает и затем в течение остальной части периода созревания постепенно падает. Подобно этому изменяется и дыхательный коэффициент, который в начале эмбриогенеза повышается с 1 до 1,5 и в дальнейшем постепенно снижается до 0,7—0,8. Эти.изменения нельзя объяснить просто на основании смены дыхательного субстрата и развития митохондрий, хотя активность боль-.шинства растворимых и митохондриальных ферментов усиливается и ослабевает в соответствии с повышением и понижением поглощения О2 и ДК, в содержании промежуточных продуктов глико-литического цикла происходят изменения, указывающие на существование дифференциальной инактивации гилколитических ферментов во время созревания.
Наблюдавшееся постепенное снижение ДК и поглощения О2 происходит в фазе развития семени, характеризующейся постоянным -содержанием массы сырого вещества. В начале этой фазы метаболическая активность семени начинает ослабевать, что, по-видимому, запрограммировано генетически. Природа стимула, вызывающего включение этого генетического фактора, неизвестна. Однако было замечено, что в этой фазе развития семян в них часто заметно снижается содержание воды и, возможно, что после-. дующее постепенное усиление испытываемого семенами водного стресса частично является причиной наблюдаемого на этой стадии изменения интенсивности дыхания. Установлено, что существует -тесная связь между активностью митохондрий и степенью их набухания или сжатия. Кроме того, обезвоживание оказывает неодинаковое действие на различные дыхательные ферменты, иг дифференциальное изменение активности дыхательных ферментов», наблюдаемое в этой фазе развития семени, может быть отражением этой дифференциальной реакции на водный стресс. Так, Колеффел в опытах с семенами гороха показал, что активность ряда, митохондрпальных ферментов возрастала, когда влажность семя— долей снижалась с 65 до 55%, в то время как дальнейшее уменьшение содержания воды вызывало резкое падение активности сукцинат- и малатоксидаз, но незначительно влияло на активность, сукцинат- и малатдегидрогеназ. Известно, что у растений митохондрии в клетках корня чувствительны к водному стрессу. Кроме того, увеличение и последующее снижение интенсивности: дыхания и ферментативной активности наблюдались в органах,, испытывавших водный стресс, например в завядающих листьях. Другими словами, предполагается, что в период созревания семя испытывает достаточно сильный водный стресс, способный: вызвать заметное изменение дыхательной активности. Марре перечисляет ряд ферментов, активность которых в период развития семян клещевины снижается. К ним относятся ферменты гликолитического и пентозофосфатного циклов, цикла Кребса и цитохромной системы. Кроме того, на конечной стадии созревания семени заметно уменьшается активность ферментов, активирующих аминокислоты, и растворимых ферментов, участвующих в синтезе белка. Эти процессы могут иметь место в семенах одних видов и отсутствовать у других, поскольку в белок-синтезирующих системах семядолей сухих семян арахиса и в зародышах пшеницы отсутствует, по-видимому, только транслируемая информационная РНК" и они способны транслировать синтетическую иРНК, например полиуридиловую кислоту, гораздо активнее, чем: аналогичные системы семян клещевины. У созревающих семян клещевины в фазе обезвоживания происходит не только распад полисом, подобный наблюдавшемуся в семенах гороха. Vicia faba, Phaseolus vulgaris и лимской фасоли, но, вероятно, и повреждение самих рибосом. В семядолях прорастающих семян Pisum arvense были обнаружены аномальные рибосомы, в которых синтез белка протекал очень-медленно, а в семядолях прорастающих семян Pisum sativum уровень полисом был настолько низок, что их практически нельзя было обнаружить. Имеется много данных, свидетельствующих о том, что падение активности ферментов во время созревания семян обусловлено снижением интенсивности синтетических и обменных процессов и что первое, в свою очередь, обусловлено изменениями метаболизма иРНК и функции рибосом. Опик предполагает, что эти изменения связаны с повышением активности рибонуклеазы. Дов показал, что в листочках томатов, испытывавших водный-стресс, активность рибонуклеазы была выше, чем в листочках, не испытывавших стресса. Некоторые качественные изменения синтеза белка на поздних стадиях созревания можно объяснить на основе происходящих во время обезвоживания изменений в ЭС и исчезновения связанных с мембранами полисом, что наблюдалось во многих тканях, испытывавших водный стресс, например в колеоптилях и в корнях кукурузы, но, кроме того, обезвоживание часто вызывает не дезорганизацию ЭС, а превращение обычно везикулярной ЭС в параллельные пластинки. Таким образом, основываясь на действии водного стресса, можно объяснить предположение, что понижение активности ферментов во время созревания в основном вызвано ослаблением их синтеза. Согласно противоположной точке зрения, многие ферменты переходят в неактивную форму. Так, Майер и Шейн показали, что из гороха можно экстрагировать гранулы, сходные с зимогеном и представляющие собой неактивную форму глюкозидазы, которую можно активировать путем мягкого протеолиза. Хотя вполне вероятно, что реакция ферментов на водный стресс выражается в их превращении в такие неактивные формы, данные о наличии подобных явлений в других тканях чрезвычайно скудны. Истинное положение вещей, существующее в семенах, вероятно, сводится к тому, что ослабление синтеза белка, усиление его распада, обратимое превращение ферментов в неактивные формы и их инактивация, обусловленная просто дефицитом водной среды, в совокупности способствуют снижению активности ферментов в процессе обезвоживания семян. Изменения дыхательной активности, происходящие в фазе постоянной массы сырого вещества, показывают, что в процессе подготовки к полной инактивации в сухом семени могут «отбираться».дыхательные системы, устойчивые к обезвоживанию. Заметные изменения в рибосомах семени происходят только к концу этой фазы, из чего видно, что они более устойчивы к действию водного стресса. Чен, Сарид и Качальски показали, что зародыши пшеницы теряют большую часть своей засухоустойчивости примерно через 72 ч после начала набухания, когда, как утверждают, начинается синтез новых, неустойчивых РНК. Гейтс указывал, что зародышевые ткани очень устойчивы к потере воды, но обезвоживание может оказывать влияние на их способность к синтезу. Суммируя изложенные данные, можно сказать, что изменение физиологической активности созревающего семени является, как доказывают Клейн и Поллок, приспособительной реакцией, благодаря котрой клетки приобретают устойчивость к высыханию. Интересно было бы знать, аналогичен ли в остальных отношениях водный стресс в семенах водному стрессу в таких органах, как листья. Известно, например, что при завядании листьев содержание гормонов в них меняется. Зависит ли содержание гормонов в семенах, хотя бы частично, от тех гормональных изменений, которые происходят в процессе развития семян под влиянием водного стресса? Белки созревающих семян очень сильно отличаются от белков-прорастающих, что, по-видимому, связано-с наличием в них различных иРНК. Отсюда следует, что на какой-то стадии развития семян в них должно происходить разрушение-старых иРНК и синтез иРНК, необходимых для синтеза белка во время прорастания. Распад полисом, наблюдаемый в высыхающих семенах, свидетельствует о разрушении; иРНК. Есть данные, что иРНК, специфичные для прорастания, синтезируются в конце процесса созревания семян и хранятся в «замаскированных» формах. Хотя и нельзя утверждать, что это качественное изменение метаболизма РНК непосредственно связано с высыханием семян, возможно, небезынтересна упомянуть, что состав оснований РНК, синтезируемой в листьях,, испытывающих водный стресс, и в полностью гидратированных листьях различен. Кесслер и Франк-Тишель указывают,, что структурные особенности молекул РНК в листьях, испытывающих стресс, такие, как высокое содержание и, возможно,, двойная нить, особенно способствуют повышению их устойчивости к стрессу. Чен и др. показали, что существует связь между устойчивостью РНК к водному стрессу и ее стабильностью в прорастающих семенах. Описанные изменения метаболизма иРНК во время созревания являются следствием событий, происходящих на генном уровне-Кроме того, в некоторых случаях было показано, что в состоянии покоя, которое развивается по мере созревания семени, происходит подавление активности хроматина. Возможно, что-обезвоживание, воздействуя непосредственно на объем клеточного, ядра и на осмотическую и ионную среду, окружающую хроматин,, вызывает упорядоченное включение и выключение определенных участков генома, т. е. регуляционный механизм, который, по-видимому, действует в гетерокарионах, как предполагает Харрис,, характерен для эукариотов вообще.
Многие механизмы, регулирующие синтез запасного белка, могут участвовать и в регуляции синтеза ферментов в развивающихся семенах. Поэтому обсуждение, касающееся накопления запасных веществ в семенах, будет ограничено вопросом о запасных белках. Регуляция синтеза других запасных веществ достаточно хорошо освещена следующими авторами: Тарнер и Дженнер составили обзоры по синтезу крахмала, а Мадд, Дреннан и Кэнвин, Харрис и Джеймс детально рассмотрели различные аспекты синтеза липидов в семенах. Запасным белкам семян посвящены недавно опубликованные-обзоры Альтшуля, Ятсу, Ори и Инглмена и Мосса. При: помощи светового и электронного микроскопов в семенах были обнаружены белковые тельца. Путем сопоставления результатов этих исследований с данными по химии белков семян было показано, что в этих тельцах, называемых алейроновыми зернами, локализована большая часть запасного белка семян. Развитие алейроновых зерен было изучено в семенах нескольких гидов с помощью электронной микроскопии. Было установлено, что клетки незрелых зародышей являются меристематическими и не содержат вакуолей. Вакуоляризация, являющаяся показателем прекращения меристематической активности и начала созревания клеток, сопровождается появлением отложений белка, связанных с разживающимся тонопластом. Вакуоли разрастаются в результате увеличения их объема, слияния мелких вакуолей или обоих этих лроцессов и в конечном счете занимают большую часть объема клетки. Белок со временем заполняет вакуоль, которая сохраняет свою мембрану. Установлено, что алейроновые зерна содержат ряд ферментов та включений, не относящихся к запасным белкам, например фитат и ферменты, характерные для лизосом. Для объяснения происхождения белка алейронового зерна был выдвинут ряд гипотез. Из них только две подтверждены детальными биохимическими исследованиями. Во-первых, возможно, что запасные белки синтезируются в белок-синтезирующих системах развивающихся вакуолей независимо от цитоплазматической системы. Грэхем, Мортон и Рейзон показали, что алейроновые тельца, выделенные из пшеницы, включали 358-сульфат и исглицин. Мортон и Рейзон назвали единицу, синтезирующую запасной белок, протеопластом и продемонстрировали возможную функцию фитата алейронового зерна путем выделения из пшеницы фосфо-трансферазы, катализирующей образование АТФ из АДФ и фитата. Они показали также, что за счет энергии этой АТФ-образующей системы бесклеточные препараты протеопластов из пшеницы могли осуществлять включение аминокислот. Однако теперь известно, что алейроновые тельца, включающие радиоактивные аминокислоты, заражены микроорганизмами. Вильсон показал, что стерильные алейроновые зерна почти полностью лишены способности включать 14С-лейцин.
Авторы второй гипотезы о происхождении алейронового белка предполагают, что белок синтезируется в связанных с мембранами полисомах и переносится в развивающиеся вакуоли по эндоплазматической сети. Установлено, что гранулярная ЭС увеличивается в период накопления белка в вакуолях. Пэйн и Боултер методом центрифугирования в градиенте плотности сахарозы выделили из развивающихся семян Vicia свободные и связанные с мембраной полисомы. Они обнаружили, что в фазе быстрого деления клеток отношение f/mb было высоким, а затем во время накопления белка снижалось. Это объяснялось скорее предпочтительным синтезом рибосом, чем превращением рибосом в mb-рибосомы. Оба класса рибосом активно участвуют в синтезе белка. Бейли, Кобб и Боултер описали метод изготовления срезов семядолей для демонстрации переноса белка из гранулярной ЭС в развивающиеся белковые вакуоли. Хотя у них и возникали затруднения с обнаружением метки, они показали, что при инкубации срезов-семядолей Vicia на растворах, содержащих меченую аминокислоту,, происходит перенос метки из ЭС в белковые вакуоли. Продолжительность этого процесса примерно 25 мин. Грубый контроль за процессом синтеза запасного белка можно-осуществлять путем введения аминокислоты в развивающееся семя, Фолкс высказал предположение, что синтез белка в семенах на ранних стадиях их развития зависит от поступления аминокислот,, образующихся в результате распада белков листа, и от того, в каких количествах отдельные аминокислоты поступают в семя. Другой грубый контрольный механизм был предложен в работах Уилера и Боултера и Велбота. Во время быстрого эмбрионального развития в семени происходит заметное увеличение содержания РНК и числа рибосом, но, по-видимому, деление клеток,, увеличение РНК и дифференциация главных органов должны завершиться раньше, чем станет возможным синтез запасных веществ. Многие исследователи объясняли это простой конкуренцией за предшественники между системами, контролирующими дифференцировку и накопление запасных веществ. В эндосперме пшеницы и в семенах кукурузы начало синтеза запасного белка сопровождалось снижением общего содержания нуклеиновых кислот. Кроме того, было показано, что во время развития эндосперма возрастает активность рибонуклеазы и, возможно, что именно этот фермент регулирует уровни РНК в семени. Ассоциация рибосом с мембранами в период развития семени: может оказывать регулирующее влияние на синтез запасного белка. Известно, что в процессе развития происходит переход от синтеза незапасного белка к синтезу запасного, поэтому должен выключаться синтез одних РНК и включаться синтез других. Кроме того, поскольку фаза синтеза запасного белка совпадает с фазой образования рибосом, есть все основания предполагать, что новая РНК связана с рибосомами. Есть данные, что гранулярная ЭС соединяется с ядерной мембраной, а с помощью электронного микроскопа были обнаружены значительная ядерная активность и изменения в ядерной мембране в течение фазы синтеза запасного белка. Преимущества, которые представляют mb-полисомы для клетки, рассматривал Кэмпбелл. Полисомы, связанные с мембранами, особенно хорошо приспособлены для синтеза белка, который должен куда-то перемещаться в цитоплазме. В ряде животных тканей, например в ткани молочной железы и печени крыс, показано, что белок, синтезированный на mb-полисомах, отличается от белков, синтезируемых на полисомах. Об интересном наблюдении сообщили Фридлендер и Веттштейн. Они показали, что между рибосомальными белками, синтезированными в клетках зародыша цыпленка на свободных и связанных с мембранами полисомах, существуют по крайней мере два отличия. Это указывает на возможность существования различий не только между информационными РНК, транслируемыми тЬ и рибосомами, но и в структуре самих рибосом. Роль мембран в регуляции развития изучена плохо, но заметные изменения в мембранах, происходящие в клетках формирующихся семян, свидетельствуют о существенной роли этих клеточных компонентов.
Метаболизм и метаболические системы в сухих семенах
Для того чтобы ферментативный процесс протекал со значительной «коростью, молекулы субстрата и образующихся веществ должны свободно диффундировать к активным центрам фермента и от них. Хотя в сухих семенах, по-видимому, не существует строгого предела метаболической активности, обусловленного отсутствием субстратов или функциональных ферментов, сама сухость семян исключает возможность метаболизма в любом принятом смысле этого слова. Тем не менее в сухих семенах во время хранения все-таки происходят изменения. Например, процесс послеуборочного дозревания легче было бы понять, если бы состояние семени допускало метаболические изменения, но обезвоживание, по-видимому, часто ускоряет этот процесс; Поэтому, прежде чем рассматривать вопрос о биохимической организации сухого семени, необходимо точно определить, что означает термин «сухой». Аксенов, Аскоченская и Петинов и Аскоченская и Аксенов изучали состояние воды в семенах многих видов растений методом ядерного магнитного резонанса. В сухих семенах они обнаружили три фракции внутриклеточной воды: прочно связанную фракцию, гидратирующую запасной крахмал; более мобильную, гидратирующую белок, и очень прочно связанную фракцию; последняя также ассоциирована с белком семян, но ее не удается обнаружить методом ЯМР. Результаты этих опытов наводят на мысль, что роль запасных веществ не ограничивается их участием в процессе прорастания. Из этих результатов следует также, что термин «сухой» в применении к семенам относителен, но вопрос о том, играет ли какая-либо фракция воды важную роль в метаболизме сухих семян, остается пока открытым. Многие исследователи, изучавшие процесс развития семян, определяли содержание метаболитов в сухих семенах. Так, Ингл и др. показали, что содержание общего азота, белка, жира, нуклеиновых кислот, растворимого азота, аминокислот, Сахаров и растворимых нуклеотидов в зародышах зрелых семян пшеницы было выше, чем на любой другой фазе созревания. Если зародыш содержит также и ферменты, способные функционировать в условиях предельного обезвоживания, то можно предположить, что в сухих семенах будут происходить метаболические изменения. Во время набухания синтезируются или активируются ферменты, связанные с мобилизацией или глюколизом. Сухое семя содержит, по-видимому, очень мало экстрагируемых функциональных ферментов этого типа. Однако семена содержат также ферменты, которые во время прорастания, очевидно, не синтезируются или не активируются. Так, Кворлс и Доусон показали, что во время прорастания уровень фосфолипазы-D в семенах гороха снижается. С их точки зрения этот фермент, хотя он и активно способствует распаду фосфолипидов в семядолях в течение прорастания и роста, был, по всей вероятности, остатком от периода созревания семян. Содержание функциональных ферментов этого типа в сухих семенах, вероятно, гораздо выше, чем содержание тех ферментов, которые активируются во время набухания. Поэтому можно утверждать, что если в сухих семенах происходят биохимические изменения, то их катализируют именно остаточные ферменты. Таким образом, применение термина «послеуборочное дозревание» к процессу прерывания покоя, происходящему во время сухого хранения, вполне допустимо как с биохимической, так и с физиологической точки зрения. Наблюдение, показавшее, что ферменты, характерные для лизосом, локализованы в отложениях запасных веществ, содержащих также значительную часть связанной воды сухого семени, в свою очередь, подтверждает точку зрения, согласно которой в сухом семени ферменты и остаточная вода вступают в соприкосновение. Изучение ультраструктуры сухих и созревающих семян показало, что в обезвоженных семенах основные клеточные органеллы часто находятся в диффузном, слабо оформленном состоянии. В результате электронно-микроскопического изучения сухих семян создается впечатление, что они биохимически неактивны, но для проверки правильности этого заключения нельзя применить обычные методы определения активности изолированных клеточных органелл, так как извлечение органелл и испытание их активности проводят обычно в водной среде, где они могут превращаться в органеллы набухших семян. Пройти мимо фактов, свидетельствующих о метаболизме сухих семян, очевидно, трудно и легче допустить, что изменения, происходящие во время хранения в сухих условиях, осуществляются неферментативным путем. Известно, что во время хранения в сухих семенах происходят цитологические и генетические изменения, поэтому снижение активности ферментов, наблюдающееся в сухих семенах во время хранения, рассматривалось как прямое указание на снижение жизнеспособности. Можно бесконечно высказывать различные предположения относительно зависимости между неферментдтивными изменениями макромолекул семени и процессами послеуборочного дозревания или снижения жизнеспособности во время сухого хранения, но, однако, значительно труднее найти этим явлениям удовлетворительное биохимическое объяснение.
Покой семян
В литературе можно найти много дискуссий по поводу определения термина «покой». Мы будем применять это слово для описания «случаев, когда семя! какого-либо вида не прорастает в таких условиях влажности, температуры и доступа кислорода, которые обычно благоприятствуют поздним стадиям прорастания и росту данного вида». Покой семян некоторых видов часто можно преодолеть путем различных обработок. Однако в так называемых естественных условиях многие формы покоя преодолеваются путем охлаждения, освещения или хранения в сухих условиях. В настоящем обсуждении покой рассматривается в этих трех аспектах. Немногочисленные имеющиеся данные о метаболических аспектах покоя свидетельствуют о том, что такое деление вполне оправдано как с биохимической, так и с экологической точки зрения.
Покой семян, нуждающихся в охлаждении
Семена, которые для выхода из состояния покоя нуждаются в охлаждении, часто содержат как ингибиторы, так и стимуляторы роста. Многочисленные данные в настоящее время подтверждают, что этот тип покоя регулируется балансом ингибиторов/стимуляторов, который изменяется в результате охлаждения. Более широко взаимодействие ингибиторов и стимуляторов освещено в недавно появившихся обзорах; настоящая дискуссия ограничена рассмотрением вопроса о том, каковы метаболические последствия взаимодействия ингибиторов и стимуляторов в охлажденных семенах. Френкленд и Уоринг обнаружили, что охлаждение семян лещины и бука приводит к повышению содержания в них гиббереллина. Заметного изменения уровней ингибиторов не наблюдалось. Сходная реакция на пониженные температуры обнаружена и у других семян, нуждающихся в охлаждении, например у ясеня. Бредбир, Росс и Бредбир указывали, что их результаты согласуются со схемой биосинтеза гиббереллина, предложенной Катсуми и Финни, согласно которой сначала образуется гиббереллин Ai, который затем превращается в А4, As и As. Кроме того, содержание гиббереллина на единицу массы в оси зародыша значительно выше, чем в семядолях охлажденных семян. По-видимому, один из гиббереллинов, возможно Ai, перемещается и»
оси в семядоли, где превращается в другие гиббереллины. Росс и Бредбир использовали известные ингибиторы биосинтеза гиббереллина для проверки гипотезы, согласно которой при охлаждении происходит деблокировка процесса биосинтеза тиббереллина, но содержание гиббереллина в охлажденных семенах не достигает высокого уровня, пока семя не будет перенесено из температурных условий, применяемых для охлаждения, в более теплые условия. Установлено, что если при 20°С обработать охлажденные семена этими ингибиторами, то прорастание семян и накопление в них гиббереллинов заметно тормозится. Однако Синска и Левак показали, что в семенах яблони во время стратификации происходит изменение содержания гиббереллинов А4 и А7. Ответ на вопрос о том, каким образом гибберелловая кислота вызывает прорастание, возможно, дает работа Джервиса, Френкленда и Черри о репрессии генов в спящих семенах лещины. Туан и Боннер обнаружили, что хроматин, выделенный из глазков спящих клубней картофеля, почти не способен поддерживать ДНК-зависимый синтез РНК в то время, как хроматин неспящих глазков служил высокоактивной матрицей для синтеза РНК. Сходные данные были получены Джервисом с сотрудниками в опытах с семенами лещины: матричная активность хроматина, выделенного из осей зародышей семян, обработанных водой, была значительно меньше, чем хроматина из семян, обработанных ГК. Вопрос о природе вещества, блокирующего синтез ГК в спящих семенах, остается открытым. В покоящихся семенах лещины был обнаружен ингибитор, сходный с абсцизовой кислотой. АБК задерживает прорастание охлажденных семян лещины так же, как известные ингибиторы биосинтеза гиббереллина, например фосфон-Д. Кроме того, АБК ингиби-рует сильное увеличение содержания эндогенных гиббереллинов, наблюдаемое обычно после переноса растений шпината с короткого дня на длинный, и снижает содержание гиббереллина в проростках кукурузы. Можно предположить два способа, которыми АБК может тормозить синтез гиббереллина в спящих семенах. Во-первых, поскольку АБК и ГК имеют, вероятно, общее биосинтетическое происхождение в цикле мевалоновой кислоты, содержание ГК может снижаться в результате отклонения предшественников к АБК, что происходит сравнительно быстро, но вследствие того, что только относительно небольшая часть общего количества мевалоната превращается в АБК, этот тип регуляции представляется мало вероятным. В противном случае АБК может тормозить по типу обратной связи образование начальных ферментов в биосинтетической последовательности. Во-вторых, АБК может препятствовать синтезу ферментов, участвующих в биосинтезе гиббереллина. Известно, что АБК снижает активность хроматина в гипокотилях редьки, а Вилье показал с помощью радиоавтографии, что АБК янгибирует синтез РНК в спящих семенах ясеня.
Синтез белка при этом не тормозится, по-видимому, за счет деятельности стабильных и РНК, сходных с постулированными «замаскированными» иРНК в прорастающих семенах. В процессе стратификации наблюдались изменения метаболизма нуклеотидов и липидов. Интересно отметить, что снижение извлекаемости рибосомаль-ной РНК лещины, наблюдаемое д'Аполлония и Бредбиром в начале периода охлаждения, можно объяснить связыванием рибосом с клеточными мембранами, т. е. процессом, который имеет, по-видимому, особенно важное значение для регуляции синтеза белка в семенах и может отражать возрастание способности охлажденных семян к биосинтезу гиббереллина.
Покой семян, нуждающихся в освещении
Вопрос о роли света в процессе прорастания семян был недавно всесторонне освещен в больших обзорах. Здесь мы коснемся возможных механизмов этого явления, поэтому придется вникать в некоторые физиологические детали. В одной из первых работ группы исследователей, работавших в Белтсвилле, было показано, что многие формы воздействия света на морфогенез растений можно интерпретировать на основе изменений фоторецепторно-го пигмента, который получил название фитохром. Гипотеза фито-хрома объясняла предшествующие наблюдения Флинта и Мак-Алистера, показавших, что свет с длиной волны 650 нм стимулировал прорастание семян салата, а с длиной 750 нм ингибировал. Она легла в основу большинства последующих объяснений прорастания семян, стимулированного светом. Поэтому настоящая дискуссия в большей мере посвящена механизму действия фитохрома. Предполагается, что в семенах существуют и другие фотосистемы, однако нет почти никаких данных об их влиянии на метаболизм. Фитохром был обнаружен в семенах спектрофотометрически. Активной его формой является, по-видимому, Р/г. Молекула Р/г имеет максимум поглощения при 730 нм, т. е. в дальней красной части спектра, и обратимо образуется в результате действия красного света на неактивную форму Рг с максимумом поглощения при 660 нм. Белый свет оказывает такое же действие, как красный, так как для превращения Рг в Р/г требуется лишь четвертая часть того количества энергии, которое необходимо для обратного действия. Смит суммировал имеющиеся в настоящее время данные о физических и оптических свойствах фитохрома. На основании результатов работ по стимулирующему действию света на прорастание семян было высказано три предположения о механизме действия Р/г: влияние на метаболизм гиббереллина, активация потенциально активных генов и действие на клеточные мембраны. Наблюдение, что ГК может заменить действие света в процессе прерывания покоя многих светочувствительных семян, привело Брайана к предположению, что Р/г активирует синтез гиббереллина, но, как можно было бы ожидать, если бы основное действие Р/г за-кого действия не оказывает. Установлено, что красный свет и ГК стимулируют прорастание семян салата синергически, а не аддитивно, как можно было бы ожидать, если бы основное действие Р/г заключалось в повышении содержания гиббереллнна. Тем не менее ингибиторы биосинтеза ГК тормозят стимулированное светом прорастание семян многих видов; поэтому можно думать, что гибберелли-ны играют какую-то роль в прорастании светочувствительных семян. Альтернативная возможность заключается в том, что Р/г стимулирует образование свободных гиббереллинов из связанных форм. Предполагается, что это происходит в этиолированных листьях пшеницы, развертывающихся при участии фитохрома. Связанные формы гиббереллнна присутствуют, по-видимому, в горохе ; возможно, что они имеются и в светочувствительных семенах. Мысль о том, что Р/г каким-то образом действует на активность генов, совпадает с точкой зрения, согласно которой прорастание семян представляет собой процесс, запрограммированный генетически. Группа Мора изучила в связи с действием фитохрома ряд ферментов, например, ферменты, катализирующие синтез антоцианина, фенилаланин-аммиаклиазу и ферменты, участвующие в метаболизме липидов. Они обнаружили, что между временем, когда под влиянием освещения красным светом образуется Р/г, и увеличением активности фермента существует лагфаза. В течение этого периода ингибиторы синтеза и трансляции РНК, которые, как известно, ингибируют прорастание, вызванное светом, тормозят увеличение количества ферментов. Можно найти возражения против выводов, основанных только на использовании ингибиторов. Однако Шопфер и Хок методом мечения по плотности неоспоримо доказали, что под действием света в проростках горчицы происходит de novo синтез ФАЛ. Этот факт служит очень веским доказательством в пользу прямого или освобождению связанных гиббереллинов, то на основе мембранной гипотезы можно объяснить роль гиббереллинов в прорастании семян, вызванном освещением. Особенно интересны данные Унзера и Мора. У многих светочувствительных семян потребность в Р/г можно снизить или совершенно преодолеть, удалив семенные оболочки, и восстановить эту потребность, подвергнув изолированные зародыши осмотическому стрессу. Наличие семенных оболочек может обусловливать необходимость света для прорастания семян, так как они препятствуют его проникновению, ограничивают газообмен или содержат ингибиторы прорастания. Оказалось, что обратимая фотореакция, в результате которой под действием красного света на Рг образуется Р/г, дает неполное представление об изменениях фитохрома в растениях. Опыты с семенами, прорастание которых ингибируется светом, изучение так называемой высокоэнергетической реакции и распада и обратимого превращения Р/г в отсутствие фотостимуляции свидетельствуют о том, что в дополнение к Рг и Р/г, последний из которых несомненно является активной формой фитохрома, существует еще ряд других форм. Если бы природа некоторых из этих форм фитохрома была изучена лучше, легче было бы понять, каким образом он регулирует морфогенез.
Послеуборочное дозревание при хранении в сухих условиях
Семена многих видов растений, закончившие развитие на родительском растении, не прорастают, если некоторое время не хранились в сухих условиях. Эта форма покоя обнаружена у семян многих зерновых культур и дикорастущих злаковых трав, а также у большого числа других видов. Однако у многих из этих видов, включая и зерновые культуры, период послеуборочного дозревания сухих семян можно заменить коротким периодом стратификации. Если семена выводят из состояния покоя путем стратификации или освещения, то для успеха обработки семена должны быть частично или полностью набухшими. В этих условиях семя биохимически активно и блок прорастания снимается, по-видимому, в результате метаболического процесса. Белдрок показал также, что продолжительность периода покоя семян пшеницы, хранящихся в сухих условиях, можно сильно сократить путем их обезвоживания. Поскольку сухие условия хранения благоприятствуют прерыванию этой формы покоя, снятие блока прорастания в результате метаболического процесса представляется сомнительным. Однако были предприняты попытки объяснить послеуборочное дозревание с биохимической точки зрения. Симпсон предполагал, что состояние покоя зародыша у Avena fatua можно приписать нарушению вызванной гиббереллином мобилизации и использования запасных веществ семени. Наиболее серьезное возражение против этого объяснения заключается в том, что синтез мобилизующих ферментов происходит, по-видимому, после прорастания. По мнению Робертса, покой, обусловленный наличием оболочек, можно частично объяснить тем, что они создают барьер на пути диффузии газов, что, в свою очередь, приводит к конкуренции за О2 между дыхательными системами семени. Однако природа процесса послеуборочного дозревания, повышающего способность семени преодолевать блоки окислительного метаболизма, пока неясна.
Процесс послеуборочного дозревания семян во время хранения в сухих условиях трудно объяснить с биохимической точки зрения, поэтому возникла тенденция рассматривать его как проявление чисто физических изменений, происходящих в семени. Однако покой, снимаемый хранением в сухих условиях, имеет, по-видимому, много аспектов, и вполне возможно, что главным событием послеуборочного дозревания является не изменение содержания регуляторов роста или свойств семенной оболочки, а какое-то неизвестное изменение способности зародыша преодолевать ограничения прорастания, которые развиваются в процессе созревания семян. Это изменение может быть биохимической природы, но раньше, чем выяснится, что оно собой представляет, нужно еще очень многое узнать о составе и состоянии ферментов и метаболитов в сухих семенах и о свойствах и активности метаболических систем в очень сухих тканях.
Прорастание семян
Метаболические изменения на самых ранних стадиях прорастания семени регулируются механизмами, которые или присутствуют в покоящихся семенах, или быстро образуются во время набухания заранее определенным путем. Таким образом, характер биохимических явлений в начале прорастания можно рассматривать как прямое проявление деятельности регуляторных систем, присутствующих в покоящихся семенах. В настоящем разделе исследуется вопрос о том, какая часть метаболического аппарата прорастающего семени уже присутствовала в нем до начала набухания. Будет рассмотрено, в какой мере активируются или синтезируются во время набухания мобилизирующие и дыхательные ферменты, и возможность присутствия в покоящемся семени в стабильной или замаскированной форме иРНК, в которой закодированы ферменты, специфичные для прорастания.
Завершение процесса созревания семян характеризуется быстрым-снижением в них содержания воды до очень низкого уровня, что-оказывает глубокое воздействие на ультраструктуру тканей семени. Потеря воды сопровождается ослаблением дыхания и снижением-синтеза белка.
Многие биохимические и цитологические изменения, сопровождающие потерю семенем воды, несомненно, являются прямым результатом пониженной доступности водной среды, в которой обычно-функционируют многие ферменты и клеточные структуры. Будет также показано, что значение некоторых изменений, протекающих в период обезвоживания, не исчерпывается их непосредственным участием в развитии жизнеспособного, зрелого, биохимически инертного семени. По мере созревания семени заметные изменения происходят и на клеточном уровне. Исследование ультраструктуры развивающихся семян таких видов, как горох Г10), Phaseolus vulgaris, Vicia faba, лимская фасоль и хлопчатник, показало, что в период накопления запасных веществ клеточные ядра, митохондрии, пластиды, эндоплазматическая сеть и диктиосомы.переходят из относительно слабо развитого состояния, в котором они находятся во время раннего эмбриогенеза, к состоянию высокой активности, которая по мере обезвоживания постепенно затухает. Эти изменения являются непосредственным проявлением изменений в состоянии клеточных мембран и, по-видимому, представляют собой активные процессы, имеющие значение для развития семени и связанные в некоторой степени с накоплением -липидов. Чтобы оценить значение обезвоживания для развития семени, необходимо выяснить, существует ли в семени, -теряющем влагу, связь между цитологическими и биохимическими изменениями. На ранних фазах развития семян клещевины и кукурузы по мере увеличения массы сухого вещества поглощение Ог возрастает и затем в течение остальной части периода созревания постепенно падает. Подобно этому изменяется и дыхательный коэффициент, который в начале эмбриогенеза повышается с 1 до 1,5 и в дальнейшем постепенно снижается до 0,7—0,8. Эти.изменения нельзя объяснить просто на основании смены дыхательного субстрата и развития митохондрий, хотя активность боль-.шинства растворимых и митохондриальных ферментов усиливается и ослабевает в соответствии с повышением и понижением поглощения О2 и ДК, в содержании промежуточных продуктов глико-литического цикла происходят изменения, указывающие на существование дифференциальной инактивации гилколитических ферментов во время созревания.
Наблюдавшееся постепенное снижение ДК и поглощения О2 происходит в фазе развития семени, характеризующейся постоянным -содержанием массы сырого вещества. В начале этой фазы метаболическая активность семени начинает ослабевать, что, по-видимому, запрограммировано генетически. Природа стимула, вызывающего включение этого генетического фактора, неизвестна. Однако было замечено, что в этой фазе развития семян в них часто заметно снижается содержание воды и, возможно, что после-. дующее постепенное усиление испытываемого семенами водного стресса частично является причиной наблюдаемого на этой стадии изменения интенсивности дыхания. Установлено, что существует -тесная связь между активностью митохондрий и степенью их набухания или сжатия. Кроме того, обезвоживание оказывает неодинаковое действие на различные дыхательные ферменты, иг дифференциальное изменение активности дыхательных ферментов», наблюдаемое в этой фазе развития семени, может быть отражением этой дифференциальной реакции на водный стресс. Так, Колеффел в опытах с семенами гороха показал, что активность ряда, митохондрпальных ферментов возрастала, когда влажность семя— долей снижалась с 65 до 55%, в то время как дальнейшее уменьшение содержания воды вызывало резкое падение активности сукцинат- и малатоксидаз, но незначительно влияло на активность, сукцинат- и малатдегидрогеназ. Известно, что у растений митохондрии в клетках корня чувствительны к водному стрессу. Кроме того, увеличение и последующее снижение интенсивности: дыхания и ферментативной активности наблюдались в органах,, испытывавших водный стресс, например в завядающих листьях. Другими словами, предполагается, что в период созревания семя испытывает достаточно сильный водный стресс, способный: вызвать заметное изменение дыхательной активности. Марре перечисляет ряд ферментов, активность которых в период развития семян клещевины снижается. К ним относятся ферменты гликолитического и пентозофосфатного циклов, цикла Кребса и цитохромной системы. Кроме того, на конечной стадии созревания семени заметно уменьшается активность ферментов, активирующих аминокислоты, и растворимых ферментов, участвующих в синтезе белка. Эти процессы могут иметь место в семенах одних видов и отсутствовать у других, поскольку в белок-синтезирующих системах семядолей сухих семян арахиса и в зародышах пшеницы отсутствует, по-видимому, только транслируемая информационная РНК" и они способны транслировать синтетическую иРНК, например полиуридиловую кислоту, гораздо активнее, чем: аналогичные системы семян клещевины. У созревающих семян клещевины в фазе обезвоживания происходит не только распад полисом, подобный наблюдавшемуся в семенах гороха. Vicia faba, Phaseolus vulgaris и лимской фасоли, но, вероятно, и повреждение самих рибосом. В семядолях прорастающих семян Pisum arvense были обнаружены аномальные рибосомы, в которых синтез белка протекал очень-медленно, а в семядолях прорастающих семян Pisum sativum уровень полисом был настолько низок, что их практически нельзя было обнаружить. Имеется много данных, свидетельствующих о том, что падение активности ферментов во время созревания семян обусловлено снижением интенсивности синтетических и обменных процессов и что первое, в свою очередь, обусловлено изменениями метаболизма иРНК и функции рибосом. Опик предполагает, что эти изменения связаны с повышением активности рибонуклеазы. Дов показал, что в листочках томатов, испытывавших водный-стресс, активность рибонуклеазы была выше, чем в листочках, не испытывавших стресса. Некоторые качественные изменения синтеза белка на поздних стадиях созревания можно объяснить на основе происходящих во время обезвоживания изменений в ЭС и исчезновения связанных с мембранами полисом, что наблюдалось во многих тканях, испытывавших водный стресс, например в колеоптилях и в корнях кукурузы, но, кроме того, обезвоживание часто вызывает не дезорганизацию ЭС, а превращение обычно везикулярной ЭС в параллельные пластинки. Таким образом, основываясь на действии водного стресса, можно объяснить предположение, что понижение активности ферментов во время созревания в основном вызвано ослаблением их синтеза. Согласно противоположной точке зрения, многие ферменты переходят в неактивную форму. Так, Майер и Шейн показали, что из гороха можно экстрагировать гранулы, сходные с зимогеном и представляющие собой неактивную форму глюкозидазы, которую можно активировать путем мягкого протеолиза. Хотя вполне вероятно, что реакция ферментов на водный стресс выражается в их превращении в такие неактивные формы, данные о наличии подобных явлений в других тканях чрезвычайно скудны. Истинное положение вещей, существующее в семенах, вероятно, сводится к тому, что ослабление синтеза белка, усиление его распада, обратимое превращение ферментов в неактивные формы и их инактивация, обусловленная просто дефицитом водной среды, в совокупности способствуют снижению активности ферментов в процессе обезвоживания семян. Изменения дыхательной активности, происходящие в фазе постоянной массы сырого вещества, показывают, что в процессе подготовки к полной инактивации в сухом семени могут «отбираться».дыхательные системы, устойчивые к обезвоживанию. Заметные изменения в рибосомах семени происходят только к концу этой фазы, из чего видно, что они более устойчивы к действию водного стресса. Чен, Сарид и Качальски показали, что зародыши пшеницы теряют большую часть своей засухоустойчивости примерно через 72 ч после начала набухания, когда, как утверждают, начинается синтез новых, неустойчивых РНК. Гейтс указывал, что зародышевые ткани очень устойчивы к потере воды, но обезвоживание может оказывать влияние на их способность к синтезу. Суммируя изложенные данные, можно сказать, что изменение физиологической активности созревающего семени является, как доказывают Клейн и Поллок, приспособительной реакцией, благодаря котрой клетки приобретают устойчивость к высыханию. Интересно было бы знать, аналогичен ли в остальных отношениях водный стресс в семенах водному стрессу в таких органах, как листья. Известно, например, что при завядании листьев содержание гормонов в них меняется. Зависит ли содержание гормонов в семенах, хотя бы частично, от тех гормональных изменений, которые происходят в процессе развития семян под влиянием водного стресса? Белки созревающих семян очень сильно отличаются от белков-прорастающих, что, по-видимому, связано-с наличием в них различных иРНК. Отсюда следует, что на какой-то стадии развития семян в них должно происходить разрушение-старых иРНК и синтез иРНК, необходимых для синтеза белка во время прорастания. Распад полисом, наблюдаемый в высыхающих семенах, свидетельствует о разрушении; иРНК. Есть данные, что иРНК, специфичные для прорастания, синтезируются в конце процесса созревания семян и хранятся в «замаскированных» формах. Хотя и нельзя утверждать, что это качественное изменение метаболизма РНК непосредственно связано с высыханием семян, возможно, небезынтересна упомянуть, что состав оснований РНК, синтезируемой в листьях,, испытывающих водный стресс, и в полностью гидратированных листьях различен. Кесслер и Франк-Тишель указывают,, что структурные особенности молекул РНК в листьях, испытывающих стресс, такие, как высокое содержание и, возможно,, двойная нить, особенно способствуют повышению их устойчивости к стрессу. Чен и др. показали, что существует связь между устойчивостью РНК к водному стрессу и ее стабильностью в прорастающих семенах. Описанные изменения метаболизма иРНК во время созревания являются следствием событий, происходящих на генном уровне-Кроме того, в некоторых случаях было показано, что в состоянии покоя, которое развивается по мере созревания семени, происходит подавление активности хроматина. Возможно, что-обезвоживание, воздействуя непосредственно на объем клеточного, ядра и на осмотическую и ионную среду, окружающую хроматин,, вызывает упорядоченное включение и выключение определенных участков генома, т. е. регуляционный механизм, который, по-видимому, действует в гетерокарионах, как предполагает Харрис,, характерен для эукариотов вообще.
Регуляция синтеза запасного белка
Многие механизмы, регулирующие синтез запасного белка, могут участвовать и в регуляции синтеза ферментов в развивающихся семенах. Поэтому обсуждение, касающееся накопления запасных веществ в семенах, будет ограничено вопросом о запасных белках. Регуляция синтеза других запасных веществ достаточно хорошо освещена следующими авторами: Тарнер и Дженнер составили обзоры по синтезу крахмала, а Мадд, Дреннан и Кэнвин, Харрис и Джеймс детально рассмотрели различные аспекты синтеза липидов в семенах. Запасным белкам семян посвящены недавно опубликованные-обзоры Альтшуля, Ятсу, Ори и Инглмена и Мосса. При: помощи светового и электронного микроскопов в семенах были обнаружены белковые тельца. Путем сопоставления результатов этих исследований с данными по химии белков семян было показано, что в этих тельцах, называемых алейроновыми зернами, локализована большая часть запасного белка семян. Развитие алейроновых зерен было изучено в семенах нескольких гидов с помощью электронной микроскопии. Было установлено, что клетки незрелых зародышей являются меристематическими и не содержат вакуолей. Вакуоляризация, являющаяся показателем прекращения меристематической активности и начала созревания клеток, сопровождается появлением отложений белка, связанных с разживающимся тонопластом. Вакуоли разрастаются в результате увеличения их объема, слияния мелких вакуолей или обоих этих лроцессов и в конечном счете занимают большую часть объема клетки. Белок со временем заполняет вакуоль, которая сохраняет свою мембрану. Установлено, что алейроновые зерна содержат ряд ферментов та включений, не относящихся к запасным белкам, например фитат и ферменты, характерные для лизосом. Для объяснения происхождения белка алейронового зерна был выдвинут ряд гипотез. Из них только две подтверждены детальными биохимическими исследованиями. Во-первых, возможно, что запасные белки синтезируются в белок-синтезирующих системах развивающихся вакуолей независимо от цитоплазматической системы. Грэхем, Мортон и Рейзон показали, что алейроновые тельца, выделенные из пшеницы, включали 358-сульфат и исглицин. Мортон и Рейзон назвали единицу, синтезирующую запасной белок, протеопластом и продемонстрировали возможную функцию фитата алейронового зерна путем выделения из пшеницы фосфо-трансферазы, катализирующей образование АТФ из АДФ и фитата. Они показали также, что за счет энергии этой АТФ-образующей системы бесклеточные препараты протеопластов из пшеницы могли осуществлять включение аминокислот. Однако теперь известно, что алейроновые тельца, включающие радиоактивные аминокислоты, заражены микроорганизмами. Вильсон показал, что стерильные алейроновые зерна почти полностью лишены способности включать 14С-лейцин.
Авторы второй гипотезы о происхождении алейронового белка предполагают, что белок синтезируется в связанных с мембранами полисомах и переносится в развивающиеся вакуоли по эндоплазматической сети. Установлено, что гранулярная ЭС увеличивается в период накопления белка в вакуолях. Пэйн и Боултер методом центрифугирования в градиенте плотности сахарозы выделили из развивающихся семян Vicia свободные и связанные с мембраной полисомы. Они обнаружили, что в фазе быстрого деления клеток отношение f/mb было высоким, а затем во время накопления белка снижалось. Это объяснялось скорее предпочтительным синтезом рибосом, чем превращением рибосом в mb-рибосомы. Оба класса рибосом активно участвуют в синтезе белка. Бейли, Кобб и Боултер описали метод изготовления срезов семядолей для демонстрации переноса белка из гранулярной ЭС в развивающиеся белковые вакуоли. Хотя у них и возникали затруднения с обнаружением метки, они показали, что при инкубации срезов-семядолей Vicia на растворах, содержащих меченую аминокислоту,, происходит перенос метки из ЭС в белковые вакуоли. Продолжительность этого процесса примерно 25 мин. Грубый контроль за процессом синтеза запасного белка можно-осуществлять путем введения аминокислоты в развивающееся семя, Фолкс высказал предположение, что синтез белка в семенах на ранних стадиях их развития зависит от поступления аминокислот,, образующихся в результате распада белков листа, и от того, в каких количествах отдельные аминокислоты поступают в семя. Другой грубый контрольный механизм был предложен в работах Уилера и Боултера и Велбота. Во время быстрого эмбрионального развития в семени происходит заметное увеличение содержания РНК и числа рибосом, но, по-видимому, деление клеток,, увеличение РНК и дифференциация главных органов должны завершиться раньше, чем станет возможным синтез запасных веществ. Многие исследователи объясняли это простой конкуренцией за предшественники между системами, контролирующими дифференцировку и накопление запасных веществ. В эндосперме пшеницы и в семенах кукурузы начало синтеза запасного белка сопровождалось снижением общего содержания нуклеиновых кислот. Кроме того, было показано, что во время развития эндосперма возрастает активность рибонуклеазы и, возможно, что именно этот фермент регулирует уровни РНК в семени. Ассоциация рибосом с мембранами в период развития семени: может оказывать регулирующее влияние на синтез запасного белка. Известно, что в процессе развития происходит переход от синтеза незапасного белка к синтезу запасного, поэтому должен выключаться синтез одних РНК и включаться синтез других. Кроме того, поскольку фаза синтеза запасного белка совпадает с фазой образования рибосом, есть все основания предполагать, что новая РНК связана с рибосомами. Есть данные, что гранулярная ЭС соединяется с ядерной мембраной, а с помощью электронного микроскопа были обнаружены значительная ядерная активность и изменения в ядерной мембране в течение фазы синтеза запасного белка. Преимущества, которые представляют mb-полисомы для клетки, рассматривал Кэмпбелл. Полисомы, связанные с мембранами, особенно хорошо приспособлены для синтеза белка, который должен куда-то перемещаться в цитоплазме. В ряде животных тканей, например в ткани молочной железы и печени крыс, показано, что белок, синтезированный на mb-полисомах, отличается от белков, синтезируемых на полисомах. Об интересном наблюдении сообщили Фридлендер и Веттштейн. Они показали, что между рибосомальными белками, синтезированными в клетках зародыша цыпленка на свободных и связанных с мембранами полисомах, существуют по крайней мере два отличия. Это указывает на возможность существования различий не только между информационными РНК, транслируемыми тЬ и рибосомами, но и в структуре самих рибосом. Роль мембран в регуляции развития изучена плохо, но заметные изменения в мембранах, происходящие в клетках формирующихся семян, свидетельствуют о существенной роли этих клеточных компонентов.
Метаболизм и метаболические системы в сухих семенах
Для того чтобы ферментативный процесс протекал со значительной «коростью, молекулы субстрата и образующихся веществ должны свободно диффундировать к активным центрам фермента и от них. Хотя в сухих семенах, по-видимому, не существует строгого предела метаболической активности, обусловленного отсутствием субстратов или функциональных ферментов, сама сухость семян исключает возможность метаболизма в любом принятом смысле этого слова. Тем не менее в сухих семенах во время хранения все-таки происходят изменения. Например, процесс послеуборочного дозревания легче было бы понять, если бы состояние семени допускало метаболические изменения, но обезвоживание, по-видимому, часто ускоряет этот процесс; Поэтому, прежде чем рассматривать вопрос о биохимической организации сухого семени, необходимо точно определить, что означает термин «сухой». Аксенов, Аскоченская и Петинов и Аскоченская и Аксенов изучали состояние воды в семенах многих видов растений методом ядерного магнитного резонанса. В сухих семенах они обнаружили три фракции внутриклеточной воды: прочно связанную фракцию, гидратирующую запасной крахмал; более мобильную, гидратирующую белок, и очень прочно связанную фракцию; последняя также ассоциирована с белком семян, но ее не удается обнаружить методом ЯМР. Результаты этих опытов наводят на мысль, что роль запасных веществ не ограничивается их участием в процессе прорастания. Из этих результатов следует также, что термин «сухой» в применении к семенам относителен, но вопрос о том, играет ли какая-либо фракция воды важную роль в метаболизме сухих семян, остается пока открытым. Многие исследователи, изучавшие процесс развития семян, определяли содержание метаболитов в сухих семенах. Так, Ингл и др. показали, что содержание общего азота, белка, жира, нуклеиновых кислот, растворимого азота, аминокислот, Сахаров и растворимых нуклеотидов в зародышах зрелых семян пшеницы было выше, чем на любой другой фазе созревания. Если зародыш содержит также и ферменты, способные функционировать в условиях предельного обезвоживания, то можно предположить, что в сухих семенах будут происходить метаболические изменения. Во время набухания синтезируются или активируются ферменты, связанные с мобилизацией или глюколизом. Сухое семя содержит, по-видимому, очень мало экстрагируемых функциональных ферментов этого типа. Однако семена содержат также ферменты, которые во время прорастания, очевидно, не синтезируются или не активируются. Так, Кворлс и Доусон показали, что во время прорастания уровень фосфолипазы-D в семенах гороха снижается. С их точки зрения этот фермент, хотя он и активно способствует распаду фосфолипидов в семядолях в течение прорастания и роста, был, по всей вероятности, остатком от периода созревания семян. Содержание функциональных ферментов этого типа в сухих семенах, вероятно, гораздо выше, чем содержание тех ферментов, которые активируются во время набухания. Поэтому можно утверждать, что если в сухих семенах происходят биохимические изменения, то их катализируют именно остаточные ферменты. Таким образом, применение термина «послеуборочное дозревание» к процессу прерывания покоя, происходящему во время сухого хранения, вполне допустимо как с биохимической, так и с физиологической точки зрения. Наблюдение, показавшее, что ферменты, характерные для лизосом, локализованы в отложениях запасных веществ, содержащих также значительную часть связанной воды сухого семени, в свою очередь, подтверждает точку зрения, согласно которой в сухом семени ферменты и остаточная вода вступают в соприкосновение. Изучение ультраструктуры сухих и созревающих семян показало, что в обезвоженных семенах основные клеточные органеллы часто находятся в диффузном, слабо оформленном состоянии. В результате электронно-микроскопического изучения сухих семян создается впечатление, что они биохимически неактивны, но для проверки правильности этого заключения нельзя применить обычные методы определения активности изолированных клеточных органелл, так как извлечение органелл и испытание их активности проводят обычно в водной среде, где они могут превращаться в органеллы набухших семян. Пройти мимо фактов, свидетельствующих о метаболизме сухих семян, очевидно, трудно и легче допустить, что изменения, происходящие во время хранения в сухих условиях, осуществляются неферментативным путем. Известно, что во время хранения в сухих семенах происходят цитологические и генетические изменения, поэтому снижение активности ферментов, наблюдающееся в сухих семенах во время хранения, рассматривалось как прямое указание на снижение жизнеспособности. Можно бесконечно высказывать различные предположения относительно зависимости между неферментдтивными изменениями макромолекул семени и процессами послеуборочного дозревания или снижения жизнеспособности во время сухого хранения, но, однако, значительно труднее найти этим явлениям удовлетворительное биохимическое объяснение.
Покой семян
В литературе можно найти много дискуссий по поводу определения термина «покой». Мы будем применять это слово для описания «случаев, когда семя! какого-либо вида не прорастает в таких условиях влажности, температуры и доступа кислорода, которые обычно благоприятствуют поздним стадиям прорастания и росту данного вида». Покой семян некоторых видов часто можно преодолеть путем различных обработок. Однако в так называемых естественных условиях многие формы покоя преодолеваются путем охлаждения, освещения или хранения в сухих условиях. В настоящем обсуждении покой рассматривается в этих трех аспектах. Немногочисленные имеющиеся данные о метаболических аспектах покоя свидетельствуют о том, что такое деление вполне оправдано как с биохимической, так и с экологической точки зрения.
Покой семян, нуждающихся в охлаждении
Семена, которые для выхода из состояния покоя нуждаются в охлаждении, часто содержат как ингибиторы, так и стимуляторы роста. Многочисленные данные в настоящее время подтверждают, что этот тип покоя регулируется балансом ингибиторов/стимуляторов, который изменяется в результате охлаждения. Более широко взаимодействие ингибиторов и стимуляторов освещено в недавно появившихся обзорах; настоящая дискуссия ограничена рассмотрением вопроса о том, каковы метаболические последствия взаимодействия ингибиторов и стимуляторов в охлажденных семенах. Френкленд и Уоринг обнаружили, что охлаждение семян лещины и бука приводит к повышению содержания в них гиббереллина. Заметного изменения уровней ингибиторов не наблюдалось. Сходная реакция на пониженные температуры обнаружена и у других семян, нуждающихся в охлаждении, например у ясеня. Бредбир, Росс и Бредбир указывали, что их результаты согласуются со схемой биосинтеза гиббереллина, предложенной Катсуми и Финни, согласно которой сначала образуется гиббереллин Ai, который затем превращается в А4, As и As. Кроме того, содержание гиббереллина на единицу массы в оси зародыша значительно выше, чем в семядолях охлажденных семян. По-видимому, один из гиббереллинов, возможно Ai, перемещается и»
оси в семядоли, где превращается в другие гиббереллины. Росс и Бредбир использовали известные ингибиторы биосинтеза гиббереллина для проверки гипотезы, согласно которой при охлаждении происходит деблокировка процесса биосинтеза тиббереллина, но содержание гиббереллина в охлажденных семенах не достигает высокого уровня, пока семя не будет перенесено из температурных условий, применяемых для охлаждения, в более теплые условия. Установлено, что если при 20°С обработать охлажденные семена этими ингибиторами, то прорастание семян и накопление в них гиббереллинов заметно тормозится. Однако Синска и Левак показали, что в семенах яблони во время стратификации происходит изменение содержания гиббереллинов А4 и А7. Ответ на вопрос о том, каким образом гибберелловая кислота вызывает прорастание, возможно, дает работа Джервиса, Френкленда и Черри о репрессии генов в спящих семенах лещины. Туан и Боннер обнаружили, что хроматин, выделенный из глазков спящих клубней картофеля, почти не способен поддерживать ДНК-зависимый синтез РНК в то время, как хроматин неспящих глазков служил высокоактивной матрицей для синтеза РНК. Сходные данные были получены Джервисом с сотрудниками в опытах с семенами лещины: матричная активность хроматина, выделенного из осей зародышей семян, обработанных водой, была значительно меньше, чем хроматина из семян, обработанных ГК. Вопрос о природе вещества, блокирующего синтез ГК в спящих семенах, остается открытым. В покоящихся семенах лещины был обнаружен ингибитор, сходный с абсцизовой кислотой. АБК задерживает прорастание охлажденных семян лещины так же, как известные ингибиторы биосинтеза гиббереллина, например фосфон-Д. Кроме того, АБК ингиби-рует сильное увеличение содержания эндогенных гиббереллинов, наблюдаемое обычно после переноса растений шпината с короткого дня на длинный, и снижает содержание гиббереллина в проростках кукурузы. Можно предположить два способа, которыми АБК может тормозить синтез гиббереллина в спящих семенах. Во-первых, поскольку АБК и ГК имеют, вероятно, общее биосинтетическое происхождение в цикле мевалоновой кислоты, содержание ГК может снижаться в результате отклонения предшественников к АБК, что происходит сравнительно быстро, но вследствие того, что только относительно небольшая часть общего количества мевалоната превращается в АБК, этот тип регуляции представляется мало вероятным. В противном случае АБК может тормозить по типу обратной связи образование начальных ферментов в биосинтетической последовательности. Во-вторых, АБК может препятствовать синтезу ферментов, участвующих в биосинтезе гиббереллина. Известно, что АБК снижает активность хроматина в гипокотилях редьки, а Вилье показал с помощью радиоавтографии, что АБК янгибирует синтез РНК в спящих семенах ясеня.
Синтез белка при этом не тормозится, по-видимому, за счет деятельности стабильных и РНК, сходных с постулированными «замаскированными» иРНК в прорастающих семенах. В процессе стратификации наблюдались изменения метаболизма нуклеотидов и липидов. Интересно отметить, что снижение извлекаемости рибосомаль-ной РНК лещины, наблюдаемое д'Аполлония и Бредбиром в начале периода охлаждения, можно объяснить связыванием рибосом с клеточными мембранами, т. е. процессом, который имеет, по-видимому, особенно важное значение для регуляции синтеза белка в семенах и может отражать возрастание способности охлажденных семян к биосинтезу гиббереллина.
Покой семян, нуждающихся в освещении
Вопрос о роли света в процессе прорастания семян был недавно всесторонне освещен в больших обзорах. Здесь мы коснемся возможных механизмов этого явления, поэтому придется вникать в некоторые физиологические детали. В одной из первых работ группы исследователей, работавших в Белтсвилле, было показано, что многие формы воздействия света на морфогенез растений можно интерпретировать на основе изменений фоторецепторно-го пигмента, который получил название фитохром. Гипотеза фито-хрома объясняла предшествующие наблюдения Флинта и Мак-Алистера, показавших, что свет с длиной волны 650 нм стимулировал прорастание семян салата, а с длиной 750 нм ингибировал. Она легла в основу большинства последующих объяснений прорастания семян, стимулированного светом. Поэтому настоящая дискуссия в большей мере посвящена механизму действия фитохрома. Предполагается, что в семенах существуют и другие фотосистемы, однако нет почти никаких данных об их влиянии на метаболизм. Фитохром был обнаружен в семенах спектрофотометрически. Активной его формой является, по-видимому, Р/г. Молекула Р/г имеет максимум поглощения при 730 нм, т. е. в дальней красной части спектра, и обратимо образуется в результате действия красного света на неактивную форму Рг с максимумом поглощения при 660 нм. Белый свет оказывает такое же действие, как красный, так как для превращения Рг в Р/г требуется лишь четвертая часть того количества энергии, которое необходимо для обратного действия. Смит суммировал имеющиеся в настоящее время данные о физических и оптических свойствах фитохрома. На основании результатов работ по стимулирующему действию света на прорастание семян было высказано три предположения о механизме действия Р/г: влияние на метаболизм гиббереллина, активация потенциально активных генов и действие на клеточные мембраны. Наблюдение, что ГК может заменить действие света в процессе прерывания покоя многих светочувствительных семян, привело Брайана к предположению, что Р/г активирует синтез гиббереллина, но, как можно было бы ожидать, если бы основное действие Р/г за-кого действия не оказывает. Установлено, что красный свет и ГК стимулируют прорастание семян салата синергически, а не аддитивно, как можно было бы ожидать, если бы основное действие Р/г заключалось в повышении содержания гиббереллнна. Тем не менее ингибиторы биосинтеза ГК тормозят стимулированное светом прорастание семян многих видов; поэтому можно думать, что гибберелли-ны играют какую-то роль в прорастании светочувствительных семян. Альтернативная возможность заключается в том, что Р/г стимулирует образование свободных гиббереллинов из связанных форм. Предполагается, что это происходит в этиолированных листьях пшеницы, развертывающихся при участии фитохрома. Связанные формы гиббереллнна присутствуют, по-видимому, в горохе ; возможно, что они имеются и в светочувствительных семенах. Мысль о том, что Р/г каким-то образом действует на активность генов, совпадает с точкой зрения, согласно которой прорастание семян представляет собой процесс, запрограммированный генетически. Группа Мора изучила в связи с действием фитохрома ряд ферментов, например, ферменты, катализирующие синтез антоцианина, фенилаланин-аммиаклиазу и ферменты, участвующие в метаболизме липидов. Они обнаружили, что между временем, когда под влиянием освещения красным светом образуется Р/г, и увеличением активности фермента существует лагфаза. В течение этого периода ингибиторы синтеза и трансляции РНК, которые, как известно, ингибируют прорастание, вызванное светом, тормозят увеличение количества ферментов. Можно найти возражения против выводов, основанных только на использовании ингибиторов. Однако Шопфер и Хок методом мечения по плотности неоспоримо доказали, что под действием света в проростках горчицы происходит de novo синтез ФАЛ. Этот факт служит очень веским доказательством в пользу прямого или освобождению связанных гиббереллинов, то на основе мембранной гипотезы можно объяснить роль гиббереллинов в прорастании семян, вызванном освещением. Особенно интересны данные Унзера и Мора. У многих светочувствительных семян потребность в Р/г можно снизить или совершенно преодолеть, удалив семенные оболочки, и восстановить эту потребность, подвергнув изолированные зародыши осмотическому стрессу. Наличие семенных оболочек может обусловливать необходимость света для прорастания семян, так как они препятствуют его проникновению, ограничивают газообмен или содержат ингибиторы прорастания. Оказалось, что обратимая фотореакция, в результате которой под действием красного света на Рг образуется Р/г, дает неполное представление об изменениях фитохрома в растениях. Опыты с семенами, прорастание которых ингибируется светом, изучение так называемой высокоэнергетической реакции и распада и обратимого превращения Р/г в отсутствие фотостимуляции свидетельствуют о том, что в дополнение к Рг и Р/г, последний из которых несомненно является активной формой фитохрома, существует еще ряд других форм. Если бы природа некоторых из этих форм фитохрома была изучена лучше, легче было бы понять, каким образом он регулирует морфогенез.
Послеуборочное дозревание при хранении в сухих условиях
Семена многих видов растений, закончившие развитие на родительском растении, не прорастают, если некоторое время не хранились в сухих условиях. Эта форма покоя обнаружена у семян многих зерновых культур и дикорастущих злаковых трав, а также у большого числа других видов. Однако у многих из этих видов, включая и зерновые культуры, период послеуборочного дозревания сухих семян можно заменить коротким периодом стратификации. Если семена выводят из состояния покоя путем стратификации или освещения, то для успеха обработки семена должны быть частично или полностью набухшими. В этих условиях семя биохимически активно и блок прорастания снимается, по-видимому, в результате метаболического процесса. Белдрок показал также, что продолжительность периода покоя семян пшеницы, хранящихся в сухих условиях, можно сильно сократить путем их обезвоживания. Поскольку сухие условия хранения благоприятствуют прерыванию этой формы покоя, снятие блока прорастания в результате метаболического процесса представляется сомнительным. Однако были предприняты попытки объяснить послеуборочное дозревание с биохимической точки зрения. Симпсон предполагал, что состояние покоя зародыша у Avena fatua можно приписать нарушению вызванной гиббереллином мобилизации и использования запасных веществ семени. Наиболее серьезное возражение против этого объяснения заключается в том, что синтез мобилизующих ферментов происходит, по-видимому, после прорастания. По мнению Робертса, покой, обусловленный наличием оболочек, можно частично объяснить тем, что они создают барьер на пути диффузии газов, что, в свою очередь, приводит к конкуренции за О2 между дыхательными системами семени. Однако природа процесса послеуборочного дозревания, повышающего способность семени преодолевать блоки окислительного метаболизма, пока неясна.
Процесс послеуборочного дозревания семян во время хранения в сухих условиях трудно объяснить с биохимической точки зрения, поэтому возникла тенденция рассматривать его как проявление чисто физических изменений, происходящих в семени. Однако покой, снимаемый хранением в сухих условиях, имеет, по-видимому, много аспектов, и вполне возможно, что главным событием послеуборочного дозревания является не изменение содержания регуляторов роста или свойств семенной оболочки, а какое-то неизвестное изменение способности зародыша преодолевать ограничения прорастания, которые развиваются в процессе созревания семян. Это изменение может быть биохимической природы, но раньше, чем выяснится, что оно собой представляет, нужно еще очень многое узнать о составе и состоянии ферментов и метаболитов в сухих семенах и о свойствах и активности метаболических систем в очень сухих тканях.
Прорастание семян
Метаболические изменения на самых ранних стадиях прорастания семени регулируются механизмами, которые или присутствуют в покоящихся семенах, или быстро образуются во время набухания заранее определенным путем. Таким образом, характер биохимических явлений в начале прорастания можно рассматривать как прямое проявление деятельности регуляторных систем, присутствующих в покоящихся семенах. В настоящем разделе исследуется вопрос о том, какая часть метаболического аппарата прорастающего семени уже присутствовала в нем до начала набухания. Будет рассмотрено, в какой мере активируются или синтезируются во время набухания мобилизирующие и дыхательные ферменты, и возможность присутствия в покоящемся семени в стабильной или замаскированной форме иРНК, в которой закодированы ферменты, специфичные для прорастания.
