В исследованиях Броуна и Рэя , Марре и его сотрудников, Бьянчетти и Сартирана и Сартирана было показано, что сахара, промежуточные продукты гликолитического цикла, кофакторы регулируют активность многих ферментов гликолитического и обратного гликолитического циклов. Например, глюкоза, гексозофосфаты и триозофосфаты снижают активность фрук-тозодифосфатазы. Это подавление активности фермента промежуточными продуктами гликолиза осуществляется как путем подавления синтеза фермента, так и его функции. Довольно специфическая регуляция индукции дыхательных ферментов была обнаружена в семядолях прорастающих семян клещевины. Глюкоза, фруктоза, галактоза и сахароза заметно повышают скорость образования растворимых гек-сокиназ, но не оказывают никакого действия на другие гликолитические ферменты. В течение самых первых стадий прорастания семян большая часть пирувата, который является продуктом и гликолиза ), окисляется до СО2. Во многих семенах за быстрым повышением интенсивности дыхания, которое наблюдается в начальных фазах прорастания, следует период, когда интенсивность дыхания сохраняется в течение нескольких часов на одном и том же уровне и ДК повышается до 2—3. В этой фазе пируват, образующийся в процессе гликолиза, превращается в этанол и в другие продукты брожения. Во многих прорастающих семенах были идентифицированы ферменты, вызывающие брожение, например алкогольдегидрогеназа . Ann и Мейсс показали, что этанол может индуцировать активность алкогольдегидрогеназы в прорастающих семенах риса, а Хагеман и Флешер предполагали, что уксусный альдегид индуцирует активность алкогольдегидрогеназы в прорастающих семенах кукурузы. Ясно выраженный эффект Пастера наблюдается в случаях улучшения доступа О2 к семенам, находящимся в процессе ферментации. Эффект Пастера можно вызвать путем удаления семенной оболочки. Это свидетельствует о том, что покровные структуры ограничивают доступ кислорода к семенам , регулируя в них процессы окисления. Когда доступ кислорода не ограничен, активность алкогольдегидро-геназы снижается и семена способны очень быстро мета-болизировать этанол. Регуляция процессов гликолиза и брожения в семенах и многих метаболических последовательностей у микроорганизмов поразительно сходна; индукция дыхательных ферментов промежуточными продуктами гликолиза и брожения в начале прорастания сходна с последовательным индуцированием ферментов промежуточными продуктами, наблюдаемым, например, в процессе биосинтеза лейцина у Neurospora. Активация метаболизма семян во время набухания и прорастания, по-видимому, представляет собой «каскадный» процесс, который можно представить следующим образом: ненабухшее семя содержит только ограниченное число ключевых ферментов; эти ферменты активируются, когда семя всасывает воду, затем продукты реакций, которые они катализируют, индуцируют развитие активности других ферментов, и это продолжается до тех пор, пока активность всех метаболических процессов в семени не достигнет оптимального уровня. Исследования ультраструктуры семян показали, что во время их прорастания заканчивается формирование митохондрий и происходит их активация. В ранней фазе прорастания, когда интенсивность дыхания резко повышается, наблюдается усиление активности цепей переноса электронов и оксидаз цикла трикарбоновых кислот, в то время как активность дегидрогеназ повышается менее быстро или остается на прежнем уровне. На этой стадии происходит, по-видимому, синтез митохондриального белка, и отношение РНК/белок в митохондриях возрастает , что может сопровождаться увеличением числа митохондрий. В течение фазы ферментации в ходе прорастания активность оксидаз и дегидрогеназ повышается. Ренсон, Уокер и Кларк наблюдали ингибирование активности сукциноксидазы при высоком содержании СО2. Этот регуляторный механизм, по-видимому, может действовать в период" ферментации, когда газообмен ограничен. В некоторых семенах развитие активных митохондрий в семядолях на ранних стадиях прорастания, по-видимому, находится под контролем зародышевой оси. Хотя в семенах гороха присутствие оси и не является необходимым для превращения в семядолях углеводов и белка в растворимые продукты, для нормальной организации митохондрий, ЭС и ядер она необходима. Многие факты показывают, что хотя в прорастающих семенах присутствуют цитохромная система и ферменты цикла трикарбоновых кислот, у многих видов только небольшая часть углерода ацетил-дофермента А полностью окисляется на этих путях митохондриального обмена. Так, в эндосперме клещевины и в щитке кукурузы глиоксилатный цикл конкурирует с циклом трикарбоновых кислот за ацетил-кофермент А, и значительная часть углерода запасных липидов превращается в углерод углеводов вследствие высокой активности фермента изоцитрат-лиазы. Таннер и Биверс идентифицировали в клещевине «катаболический глиоксилатный цикл», регулируемый АДФ, в ходе которого путем окисления ацетил-кофермента А до СО2 образуется АТФ. Ферменты глиокси-латного цикла во многих семенах, очевидно, локализованы в глиоксисомах, поэтому пространственно отделены от митохондриального цикла трикарбоновых кислот. Здесь, по-видимому, происходит скорее компартментация метаболизма ацетил-кофермента А, чем прямая конкуренция между циклами трикарбоновых кислот и глиоксилат-ным за это соединение. Через 15 мин после того, как 14С-этанол поступает в срезы гороха, метка обнаруживается в аспарагиновой кислоте, а через 30 мин и в других аминокислотах, например метионине. Оакс и Биверс показали, что при введении в щиток кукурузы 14С-ацетата метка быстро обнаруживается в глутамате. По-видимому, во многих прорастающих семенах промежуточные продукты цикла трикарбоновых кислот используются скорее как предшественники для синтеза аминокислот и на других направлениях метаболизма, чем в качестве промежуточных продуктов в процессе полного окисления ацетил-кофермента А. Камерон и Коссинс обнаружили в прорастающих семенах гороха значительный отток а-оксиглутарата для поддержания биосинтеза аминокислот. Многие исследования показали, что в прорастающих семенах дыхательные цепи переноса электронов могут находиться не только в митохондриях. Спрегт и Йемм и Мепсон и Мустафф исследовали возможность присутствия аскорбиновой кислоты и глютатиона в растворимых системах и их способность обусловливать продолжающееся увеличение поглощения Ог в конце прорастания, когда активность митохондрий падает. Многие семена содержат фитат, запас фосфора и катионы, необходимые для прорастания. Дыхание можно контролировать, регулируя доступность фосфата для окислительного фосфорилирова-ния. Гидролитический фермент фитаза синтезируется во время прорастания семян. Неорганический фосфат подавляет синтез фитазы. Ингибирование синтеза фермента фосфатом сходно с торможением, которое оказывает актиномицин D, в связи с чем возникло предположение, что действие фосфата заключается в подавлении синтеза специфичной для фитазы иРНК. Сходный конечный продукт, ингибируя активность фермента, по-видимому, регулирует и мобилизацию липидов в семенах клещевины. Превращение жиров в углеводы в прорастающих семенах включает Р-окисление, глиоксилатный и гликолитический циклы. Дево и Коган-Чарльз показали полное превращение жиров в углеводы и отток последних из эндосперма в зародышевую ось во время прорастания. Это превращение характеризуется низким ДК. В семенах и проростках обнаружены липазы и липооксидазы. В семенах идентифицированы ферменты, осуществляющие р-окисление жирных кислот. Известно, что они локализованы в клеточных включениях, называемых глиоксисомы или пероксисомы. В глиоксисомах эндосперма клещевины были обнаружены также ферменты глиоксилатного цикла. Глиоксисомы обнаружены в семенах многих культур, например арахиса , кукурузы и сосны. Глиоксисомы быстро синтезируются во время прорастания. Параллельно с развитием глиоксисом и их последующим уменьшением происходит изменение активности ферментов-маркеров изоцитрат-лиазы и малат-синтазы. Увеличение активности этих двух ферментов происходит в результате синтеза de novo. Под электронным микроспоком видно, что глиоксисомы кукурузы представляют собой крупные включения, связанные с мембраной; по-видимому, они образуются в первые три дня прорастания из более мелких и более плотных телец. Чинг установил, что сходным образом глиоксисомы развиваются в семенах сосны. Предполагается, что синтез глиоксисом осуществляется стабильными иРНК и рибосомами в прежде существовавших глиоксисомах. В этой связи интересно отметить, что была обнаружена РНК , связанная с глиоксисомами. Приели и Фоуден не смогли обнаружить влияние аминокислотного аналога на развитие активности кислой фосфатазы и изоцитрат-лиазы в семенах маша, гороха, огурцов, подсолнечника и тыквы; они полагают, что эти ферменты образуются во время прорастания из зимогенолодобных неактивных форм. Через 4—13 дней после начала прорастания число глиоксисом и активность связанных с ними ферментов уменьшаются параллельно истощению запасов липидов. Уменьшение активности ферментов глиоксилатного цикла происходит скорее вследствие ослабления их синтеза в ходе нормального обмена, чем в результате специфического распада. Оно связано с распадом глиоксисом и освобождением ферментов в цитозоль. Развитие глиоксисом, уменьшение их числа и активности связанных с ними ферментов так тесно следуют за повышением и снижением содержания жирных кислот, образовавшихся в результате гидролиза запасных липидов, что можно предположить наличие причинной зависимости между этими изменениями. Иными словами, образование ферментов глиоксисом может быть индуцировано или
жирными кислотами, или какими-либо их производными. Кроме того, продолжающемуся использованию этой системой жирных кислот благоприятствует константа равновесия реакции сахарозофосфат-синтетазы, которая тесно связана с синтезом сахарозы и ее использованием в развивающихся тканях. Таким образом ясно, что для регуляции мобилизации липидов при пространственном разделении прорастания одинаково важное значение имеет и индукция активности фермента, и регуляция по принципу обратной связи. Интересно отметить, что глюкоза ингибирует синтез изоцитратлиазы в семенах клещевины. Классическим контрольным механизмом является подавление активности ферментов, катализирующих одну из первых реакций процесса, его конечными продуктами. Поэтому можно, вероятно, считать, что «каскадный» процесс, описанный в связи с индукцией активности дыхательных ферментов, регулируется очень чувствительным механизмом, действие которого основано как на активации субстрата, так и на подавлении активности фермента конечным продуктом. В прорастающих семенах показано существование регулируемого гормоном или субстратом индуцированного синтеза ряда других ферментов. Многие из них приводят Филнер и др. в обзоре об индукции ферментативной активности в растениях.
Мысль о том, что в прорастающих семенах могут существовать замаскированные, или долгоживущие, формы информационной РНК, возникла в связи с необходимостью объяснить сходство между ранними метаболическими изменениями, происходящими при прорастании семян и на ранних стадиях эмбриогенеза у многих животных. Так, при оплодотворении яйца морского ежа происходит активация синтеза белка. Этот процесс в безъядерных клетках наблюдается и в присутствии таких ингибиторов синтеза РНК, как актиномицин D. Предполагается, что иРНК уже присутствует в яйце и что оплодотворение стимулирует скорее ее трансляцию, чем транскрипцию. В животных клетках идентифицировано много частиц и предшественников, которые, по-видимому, содержат запасную иРНК, и это привело Спирина к предположению, что синтез белка на ранних стадиях эмбриогенеза регулируется упорядоченным превращением предшественников в активные полисомы. Чен, Сарид и Качальски сравнили РНК сухих зародышей семян пшеницы и зародышей, набухавших в течение 48 и 48—72 ч, используя метод гибридизации ДНК с РНК. Оказалось, что около 1,15% генома зародыша пшеницы закодировано в РНК, которая не является ни рибосомальной РНК , ни растворимой. Далее методом конкурентной гибридизации было показано, что РНК зародышей после их набухания в течение 48 ч идентична РНК сухих зародышей, но отличается от РНК зародышей, набухавших в течение 48—72 ч. Эти результаты привели к выводу, что через 48—72 ч от начала набухания появляется новый вид иРНК, и поекольку заметного увеличения активности генома не отмечалось, синтез этого нового вида иРНК должен, очевидно, включаться после выключения синтеза старой иРНК. Если ни рибосомальная, ни растворимая РНК пшеничных зародышей не является, как предполагают авторы, информационной РНК, то фракция, присутствующая на первой стадии прорастания, идентична иРНК, хранящейся в сухом зародыше, и синтез новой иРНК начинается только на второй стадии прорастания, т. е. через 48—72 ч после начала набухания. Серьезное возражение, которое вызывают эти исследования, заключается в том, что применявшиеся методы гибридизации неспецифичны или не настолько чувствительны, чтобы дать Чену и его коллегам основание для сделанных ими выводов. Из опытов с РНК животного происхождения ясно, что, если РНК кодируется на том участке генома, который гибридизирует с нерибосомальной, нерастворимой фракцией всей РНК клетки, ее нельзя считать информационной. Большая часть этой РНК является, вероятно, ядерной РНК, которая никогда не переходит в цитоплазму , и только очень небольшая часть гетерогенной ядерной РНК достигает когда-либо рибосом и транслируется. Технические трудности, препятствующие прямой идентификации фракции иРНК в общих препаратах РНК семян, настолько серьезны, что значительно более веские доказательства существования замаскированных форм иРНК можно получить в результате изучения иРНК более косвенными методами. Информационную РНК, ассоциированную с рибосомами в поли-сомных агрегатах, можно идентифицировать общепринятыми методами, такими, как центрифугирование в градиенте плотности сахарозы и использование бесклеточных белок-синтезирующих систем. Маркус и Фили изучали синтез белка в семядолях арахиса и в зародышах пшеницы во время набухания. Они обнаружили активацию этого процесса в фазе набухания. В зародышах пшеницы через 16 ч включение меченой аминокислоты в белок возросло почти в 130 раз. Пуромицин, ингибитор функции рибосом, подавляет это увеличение. Отношение числа моносом к числу полисом при набухании семян понижается. Актиномицин Д — ингибитор синтеза РНК, не подавляет активацию синтеза белка и увеличение числа полисом. Маркус и Фили предполагают, что активация иРНК во время набухания может происходить в результате нарушения пространственного разобщения рибосом и иРНК, что приводит к формированию полисом в результате синтеза иРНК или удаления ингибитора, препятствующего связыванию иРНК с рибосомами, или в результате изменений в самих рибосомах, благодаря которым они приобретают способность связываться с и РНК. Сходные данные об увеличении числа полисом во время прорастания были получены в опытах с семенами арахиса , сосны смолистой , Pisum arvense и белого клена , а также в опытах с прорастающими пыльцевыми зернами , спорами грибов и бактерий. Имеются данные, что новые полисомы, появляющиеся во время прорастания, связаны с мембраной . Увеличение числа полисом может происходить в результате активации образования рибосом пли независимо от этого процесса. Есть данные, что повышение способности препаратов рибосом включать аминокислоты в белок в бесклеточных системах происходит параллельно увеличению числа полисом на ранних стадиях прорастания. Второй подход к изучению иРНК семян основан на использовании ингибиторов синтеза РНК и белка. Смысл его в следующем. В системе, где синтез белка можно подавить, вводя в нее ингибиторы белкового синтеза , но нельзя, используя ингибиторы синтеза РНК , иРНК должна быть долгоживущей. Дьюр и Уотерс , Уотерс и Дьюр выделили полисомы, меченные 32Р, и полисомную РНК из семян хлопчатника, которые в течение 4 ч набухали в актиномицине D, а в последующие 12 ч метились. Актиномицин D в концентрации 20 мкг/мл на 63% подавлял включение 32Р в РНК, но не оказывал никакого влияния на включение 14С аминокислот в растворимый белок. Актиномицин D снижал также включение 32Р в полисомы, но не изменял соотношение моносом и полисом. Сходным образом актиномицин D снизил больше чем на 60% включение 32Р в полисомную РНК, но, судя по профилю оптической плотности после центрифугирования в градиенте плотности сахарозы, никаких изменений в количестве РНК не происходило. При фракционировании в градиенте плотности сахарозы ядерной РНК зародышей, набухавших 12 ч и меченных в течение 30 мин 32Р-РНК, была обнаружена фракция с высокой удельной активностью, характеризующаяся промежуточным между ДНК и рРНК составом оснований и чувствительностью к актиномицину D. Таким образом, во время прорастания семян хлопчатника и пшеницы происходит синтез РНК, но ингибирование этого процесса актиномицином D не вызывает подавления ни синтеза белка, ни прорастания семян. Контуры полисом в условиях ингибирования актиномицином D не изменялись. Ингибиторы оказывают неодинаковое влияние на метаболизм семян разных видов. Показано, что циклогексимид ингибирует синтез белка в рибосомах семядолей арахиса , но не подавляет этот процесс в рибосомах пшеницы или клещевины. Сообщалось, что актиномицин D ингибирует синтез РНК в семенах пшеницы и хлопчатника , но Марре указал, что в опытах этих авторов отсутствуют четкие доказательства какого-либо действия актиномицина D на синтез иРНК и вообще, что при использовании антибиотиков в достаточно высоких концентрациях происходит подавление многих процессов, таких как синтез ферментов, рост и дыхание. Даже при изучении действия актиномици-на D на образование одного и того же фермента в семенах различных растений, например изоцитрат-лиазы в семенах арбуза и арахиса , были получены противоречивые результаты. Это заставляет предполагать, что может существовать видовая специфичность реакции на эти ингибиторы. Другая сложность, ограничивающая применение циклогексимида и актиномицина D, связана с отсутствием специфичности действия этих антиметаболитов в растениях. Есть данные, что циклогексимид препятствует переносу энергии и поглощению ионов незелеными тканями , а актиномицин D йнгибирует дыхание и образование АТФ в лейкоцитах человека, больного лейкемией. Совершенно очевидно, что, прежде чем делать выводы из результатов опытов по влиянию ингибиторов на семена, следует убедиться, что их действие на метаболизм и РНК белка специфично. Третий подход состоит в изучении синтеза специфических белков во время прорастания, так как метаболизм специфической иРНК можно, понвидимому, исследовать, изучая синтез белка, который в ней закодирован. Чтобы связать синтез белка с метаболизмом иРНК в таких исследованиях, принимается, что изучаемый белок синтезируется de novo во время прорастания. Это было безусловно доказано методом мечения по плотности только для нескольких ферментов, таких, как изоцитрат-лиаза и малат-синтаза арахиса и а-амилаза , протеаза и пероксидазы ячменя . Айл и Дьюр изучали действие актиномицина D и циклогексимида на синтез протеазы в семядолях хлопчатника. Во время нормального прорастания активность протеазы развивается только через 24 ч, достигая максимума примерно через три дня, а затем постепенно снижается. Установлено, что 24-часовая лаг-фаза не является, вероятно, результатом действия ингибитора протеазы, а представляет собой период, в течение которого в семени отсутствует как активная, так и неактивная протеаза. Если семя набухает в циклогексимиде, активность фермента совсем не проявляется, даже если семя переносится на агаровую среду, не содержащую циклогексимида. Циклогексимид, внесенный в любое время в течение первых трех дней прорастания, немедленно подавляет дальнейшее развитие протеазной активности. Изменение реакции на циклогексимид является, по-видимому, результатом изменений в синтезе фермента, поскольку они влияют на включение-аминокислоты в белок и на удельную активность белка, синтезируемого во время ингибирования циклогексимидом. Кроме того, актиномицин D в концентрациях, ингибирующих синтез всех РНК, обнаруживаемых путем включения 32Р, оказывает слабое действие на развитие активности протеазы в цельных семенах или в изолированных семядолях , за исключением тех случаев, когда длительная экспозиция в актиномицине D вызывает некроз ткани. Пытаясь установить, на какой фазе развития зародыша синтезируется иРНК для протеазы, Айл и Дьюр обрабатывали зародыши различного-возраста актиномицином D и изучали развитие активности протеазы на ранних стадиях прорастания на агаре. Ясно, что иРНК накапливалась в семенах, когда масса зародыша достигала 100 мг, но на стадии, когда она составляла 95 мг, иРНК в семени отсутствовала. Поэтому синтез и хранение" иРНК, в которой закодирована протеаза семени хлопчатника, должны были происходить в период, когда развитие зародыша завершилось примерно на 60%. Айл и Дьюр исследовали природу механизма, который задерживает трансляцию запасных иРНК до начала набухания. Они установили, что и АБК, и экстракт стенок семяпочки ингибируюг синтез протеазы в преждевременно проросших зародышах на той стадии развития, когда, как известно, происходит синтез специфической для протеазы иРНК. Для этого ингибирования необходимсинтез РНК, так как актиномицин D снимает действие как АБК, так и вытяжки из семяпочки. Айл и Дьюр предложили изображенную на рисунке 71 схему гормональной регуляции синтеза белков,, необходимых" для прорастания на той стадии развития семени хлопчатника, когда происходит синтез иРНК, специфической для протеазы. Трансляция замаскированной и РНК семян пшеницы также регулируется, по-видимому, гормонами растений, такими, как АБК и ГК. Уолтон и др. полагают, что АБК ингибирует синтез белка в изолированных осях семян бобовых на уровне трансляции.
жирными кислотами, или какими-либо их производными. Кроме того, продолжающемуся использованию этой системой жирных кислот благоприятствует константа равновесия реакции сахарозофосфат-синтетазы, которая тесно связана с синтезом сахарозы и ее использованием в развивающихся тканях. Таким образом ясно, что для регуляции мобилизации липидов при пространственном разделении прорастания одинаково важное значение имеет и индукция активности фермента, и регуляция по принципу обратной связи. Интересно отметить, что глюкоза ингибирует синтез изоцитратлиазы в семенах клещевины. Классическим контрольным механизмом является подавление активности ферментов, катализирующих одну из первых реакций процесса, его конечными продуктами. Поэтому можно, вероятно, считать, что «каскадный» процесс, описанный в связи с индукцией активности дыхательных ферментов, регулируется очень чувствительным механизмом, действие которого основано как на активации субстрата, так и на подавлении активности фермента конечным продуктом. В прорастающих семенах показано существование регулируемого гормоном или субстратом индуцированного синтеза ряда других ферментов. Многие из них приводят Филнер и др. в обзоре об индукции ферментативной активности в растениях.
Замаскированная информационная РНК и прорастание семян
Мысль о том, что в прорастающих семенах могут существовать замаскированные, или долгоживущие, формы информационной РНК, возникла в связи с необходимостью объяснить сходство между ранними метаболическими изменениями, происходящими при прорастании семян и на ранних стадиях эмбриогенеза у многих животных. Так, при оплодотворении яйца морского ежа происходит активация синтеза белка. Этот процесс в безъядерных клетках наблюдается и в присутствии таких ингибиторов синтеза РНК, как актиномицин D. Предполагается, что иРНК уже присутствует в яйце и что оплодотворение стимулирует скорее ее трансляцию, чем транскрипцию. В животных клетках идентифицировано много частиц и предшественников, которые, по-видимому, содержат запасную иРНК, и это привело Спирина к предположению, что синтез белка на ранних стадиях эмбриогенеза регулируется упорядоченным превращением предшественников в активные полисомы. Чен, Сарид и Качальски сравнили РНК сухих зародышей семян пшеницы и зародышей, набухавших в течение 48 и 48—72 ч, используя метод гибридизации ДНК с РНК. Оказалось, что около 1,15% генома зародыша пшеницы закодировано в РНК, которая не является ни рибосомальной РНК , ни растворимой. Далее методом конкурентной гибридизации было показано, что РНК зародышей после их набухания в течение 48 ч идентична РНК сухих зародышей, но отличается от РНК зародышей, набухавших в течение 48—72 ч. Эти результаты привели к выводу, что через 48—72 ч от начала набухания появляется новый вид иРНК, и поекольку заметного увеличения активности генома не отмечалось, синтез этого нового вида иРНК должен, очевидно, включаться после выключения синтеза старой иРНК. Если ни рибосомальная, ни растворимая РНК пшеничных зародышей не является, как предполагают авторы, информационной РНК, то фракция, присутствующая на первой стадии прорастания, идентична иРНК, хранящейся в сухом зародыше, и синтез новой иРНК начинается только на второй стадии прорастания, т. е. через 48—72 ч после начала набухания. Серьезное возражение, которое вызывают эти исследования, заключается в том, что применявшиеся методы гибридизации неспецифичны или не настолько чувствительны, чтобы дать Чену и его коллегам основание для сделанных ими выводов. Из опытов с РНК животного происхождения ясно, что, если РНК кодируется на том участке генома, который гибридизирует с нерибосомальной, нерастворимой фракцией всей РНК клетки, ее нельзя считать информационной. Большая часть этой РНК является, вероятно, ядерной РНК, которая никогда не переходит в цитоплазму , и только очень небольшая часть гетерогенной ядерной РНК достигает когда-либо рибосом и транслируется. Технические трудности, препятствующие прямой идентификации фракции иРНК в общих препаратах РНК семян, настолько серьезны, что значительно более веские доказательства существования замаскированных форм иРНК можно получить в результате изучения иРНК более косвенными методами. Информационную РНК, ассоциированную с рибосомами в поли-сомных агрегатах, можно идентифицировать общепринятыми методами, такими, как центрифугирование в градиенте плотности сахарозы и использование бесклеточных белок-синтезирующих систем. Маркус и Фили изучали синтез белка в семядолях арахиса и в зародышах пшеницы во время набухания. Они обнаружили активацию этого процесса в фазе набухания. В зародышах пшеницы через 16 ч включение меченой аминокислоты в белок возросло почти в 130 раз. Пуромицин, ингибитор функции рибосом, подавляет это увеличение. Отношение числа моносом к числу полисом при набухании семян понижается. Актиномицин Д — ингибитор синтеза РНК, не подавляет активацию синтеза белка и увеличение числа полисом. Маркус и Фили предполагают, что активация иРНК во время набухания может происходить в результате нарушения пространственного разобщения рибосом и иРНК, что приводит к формированию полисом в результате синтеза иРНК или удаления ингибитора, препятствующего связыванию иРНК с рибосомами, или в результате изменений в самих рибосомах, благодаря которым они приобретают способность связываться с и РНК. Сходные данные об увеличении числа полисом во время прорастания были получены в опытах с семенами арахиса , сосны смолистой , Pisum arvense и белого клена , а также в опытах с прорастающими пыльцевыми зернами , спорами грибов и бактерий. Имеются данные, что новые полисомы, появляющиеся во время прорастания, связаны с мембраной . Увеличение числа полисом может происходить в результате активации образования рибосом пли независимо от этого процесса. Есть данные, что повышение способности препаратов рибосом включать аминокислоты в белок в бесклеточных системах происходит параллельно увеличению числа полисом на ранних стадиях прорастания. Второй подход к изучению иРНК семян основан на использовании ингибиторов синтеза РНК и белка. Смысл его в следующем. В системе, где синтез белка можно подавить, вводя в нее ингибиторы белкового синтеза , но нельзя, используя ингибиторы синтеза РНК , иРНК должна быть долгоживущей. Дьюр и Уотерс , Уотерс и Дьюр выделили полисомы, меченные 32Р, и полисомную РНК из семян хлопчатника, которые в течение 4 ч набухали в актиномицине D, а в последующие 12 ч метились. Актиномицин D в концентрации 20 мкг/мл на 63% подавлял включение 32Р в РНК, но не оказывал никакого влияния на включение 14С аминокислот в растворимый белок. Актиномицин D снижал также включение 32Р в полисомы, но не изменял соотношение моносом и полисом. Сходным образом актиномицин D снизил больше чем на 60% включение 32Р в полисомную РНК, но, судя по профилю оптической плотности после центрифугирования в градиенте плотности сахарозы, никаких изменений в количестве РНК не происходило. При фракционировании в градиенте плотности сахарозы ядерной РНК зародышей, набухавших 12 ч и меченных в течение 30 мин 32Р-РНК, была обнаружена фракция с высокой удельной активностью, характеризующаяся промежуточным между ДНК и рРНК составом оснований и чувствительностью к актиномицину D. Таким образом, во время прорастания семян хлопчатника и пшеницы происходит синтез РНК, но ингибирование этого процесса актиномицином D не вызывает подавления ни синтеза белка, ни прорастания семян. Контуры полисом в условиях ингибирования актиномицином D не изменялись. Ингибиторы оказывают неодинаковое влияние на метаболизм семян разных видов. Показано, что циклогексимид ингибирует синтез белка в рибосомах семядолей арахиса , но не подавляет этот процесс в рибосомах пшеницы или клещевины. Сообщалось, что актиномицин D ингибирует синтез РНК в семенах пшеницы и хлопчатника , но Марре указал, что в опытах этих авторов отсутствуют четкие доказательства какого-либо действия актиномицина D на синтез иРНК и вообще, что при использовании антибиотиков в достаточно высоких концентрациях происходит подавление многих процессов, таких как синтез ферментов, рост и дыхание. Даже при изучении действия актиномици-на D на образование одного и того же фермента в семенах различных растений, например изоцитрат-лиазы в семенах арбуза и арахиса , были получены противоречивые результаты. Это заставляет предполагать, что может существовать видовая специфичность реакции на эти ингибиторы. Другая сложность, ограничивающая применение циклогексимида и актиномицина D, связана с отсутствием специфичности действия этих антиметаболитов в растениях. Есть данные, что циклогексимид препятствует переносу энергии и поглощению ионов незелеными тканями , а актиномицин D йнгибирует дыхание и образование АТФ в лейкоцитах человека, больного лейкемией. Совершенно очевидно, что, прежде чем делать выводы из результатов опытов по влиянию ингибиторов на семена, следует убедиться, что их действие на метаболизм и РНК белка специфично. Третий подход состоит в изучении синтеза специфических белков во время прорастания, так как метаболизм специфической иРНК можно, понвидимому, исследовать, изучая синтез белка, который в ней закодирован. Чтобы связать синтез белка с метаболизмом иРНК в таких исследованиях, принимается, что изучаемый белок синтезируется de novo во время прорастания. Это было безусловно доказано методом мечения по плотности только для нескольких ферментов, таких, как изоцитрат-лиаза и малат-синтаза арахиса и а-амилаза , протеаза и пероксидазы ячменя . Айл и Дьюр изучали действие актиномицина D и циклогексимида на синтез протеазы в семядолях хлопчатника. Во время нормального прорастания активность протеазы развивается только через 24 ч, достигая максимума примерно через три дня, а затем постепенно снижается. Установлено, что 24-часовая лаг-фаза не является, вероятно, результатом действия ингибитора протеазы, а представляет собой период, в течение которого в семени отсутствует как активная, так и неактивная протеаза. Если семя набухает в циклогексимиде, активность фермента совсем не проявляется, даже если семя переносится на агаровую среду, не содержащую циклогексимида. Циклогексимид, внесенный в любое время в течение первых трех дней прорастания, немедленно подавляет дальнейшее развитие протеазной активности. Изменение реакции на циклогексимид является, по-видимому, результатом изменений в синтезе фермента, поскольку они влияют на включение-аминокислоты в белок и на удельную активность белка, синтезируемого во время ингибирования циклогексимидом. Кроме того, актиномицин D в концентрациях, ингибирующих синтез всех РНК, обнаруживаемых путем включения 32Р, оказывает слабое действие на развитие активности протеазы в цельных семенах или в изолированных семядолях , за исключением тех случаев, когда длительная экспозиция в актиномицине D вызывает некроз ткани. Пытаясь установить, на какой фазе развития зародыша синтезируется иРНК для протеазы, Айл и Дьюр обрабатывали зародыши различного-возраста актиномицином D и изучали развитие активности протеазы на ранних стадиях прорастания на агаре. Ясно, что иРНК накапливалась в семенах, когда масса зародыша достигала 100 мг, но на стадии, когда она составляла 95 мг, иРНК в семени отсутствовала. Поэтому синтез и хранение" иРНК, в которой закодирована протеаза семени хлопчатника, должны были происходить в период, когда развитие зародыша завершилось примерно на 60%. Айл и Дьюр исследовали природу механизма, который задерживает трансляцию запасных иРНК до начала набухания. Они установили, что и АБК, и экстракт стенок семяпочки ингибируюг синтез протеазы в преждевременно проросших зародышах на той стадии развития, когда, как известно, происходит синтез специфической для протеазы иРНК. Для этого ингибирования необходимсинтез РНК, так как актиномицин D снимает действие как АБК, так и вытяжки из семяпочки. Айл и Дьюр предложили изображенную на рисунке 71 схему гормональной регуляции синтеза белков,, необходимых" для прорастания на той стадии развития семени хлопчатника, когда происходит синтез иРНК, специфической для протеазы. Трансляция замаскированной и РНК семян пшеницы также регулируется, по-видимому, гормонами растений, такими, как АБК и ГК. Уолтон и др. полагают, что АБК ингибирует синтез белка в изолированных осях семян бобовых на уровне трансляции.
