Выделение почвенных грибов в чистые культуры
Почвенные грибы — обширная и сложная экологическая группа организмов. Среди них имеются представители, поражающие насекомых, нематод, корни растений; многие виды развиваются на экскрементах животных, растительных остатках; известны грибы-микоризообразователи. Таким образом, большинству грибов, обитающих в почвах, свойственна приуроченность к определенному субстрату. Эту особенность широко используют микологи при выделении некоторых видов и групп грибов в чистые культуры на питательные среды. Предложено большое количество питательных сред, содержащих различные источники углерода и азота.
Выделение грибов из почвы
Для выделения грибов из почв обычно используют твердые (агаризованные) питательные среды с легкодоступными источниками углерода — сахарозой, глюкозой, декстрозой. К таким средам относятся агаризованная среда Чапека, картофельнодекстрозныи агар, агаризованное пивное сусло. С помощью этих питательных сред обнаруживают и учитывают в основном быстрорастущие и обильноспороносящие таксоны (виды Penicillium Link ex Fr., Aspergillus Micheli ex Fr. и др.).
Выделение грибов на селективные среды
При экологическом анализе микофлоры почв, т. е. учете грибов, приуроченных к определенным субстратам, применяют разные селективные питательные среды. Так, целлюлозоразрушающие грибы изолируют на питательные среды, содержащие целлюлозу (фильтровальную бумагу) или же синтетические среды с целлюлозой либо карбоксиметил-целлюлозой. Для выделения грибов на фильтровальную бумагу последнюю нарезают полосками, складывают продольными складками («гармошкой») и помещают в пробирки. Потом в каждую пробирку добавляют 2—3 мл жидкой среды Чапека или Гетчинсона без источника углерода и стерилизуют 30 мин при температуре 115° С. Грибы, способные разлагать лигнин, изолируют на питательные среды с лигнином. Для обнаружения в почве грибов, принимающих участие в разложении гумуса, к питательным средам прибавляют в качестве источника углерода и азота гуматнатрия. Эти же грибы можно выделять и на почвенный агар — вытяжку почвы с агаром. Для этого необходимое количество воздушно-сухой измельченной почвы (например, 500 г) заливают водой (1 л), настаивают сутки периодически взбалтывая, затем кипятят 30 мин и фильтруют через 1—2 слоя фильтровальной бумаги, после чего восстанавливают прежний объем жидкости, устанавливают нужный уровень рН однозамещенным фосфорнокислым калием, добавляют агар-агар (15—20 г), разливают в посуду и стерилизуют. Грибы, которые могут расти в условиях дефицита органических веществ, выделяют на голодный агар, который готовят из расчета 15—20 г агар-агара на 1 л воды. Предложены также питательные среды, предусматривающие выявление в почве определенных групп грибов. Так, например, виды Fusarium Link, ex Fr. выделяют на агаризованную среду, содержащую пентахлорнитробензол (0,5 г на 1 л среды). В почвах грибы находятся в ассоциациях с другими организмами. Поэтому для подавления роста некоторой сопутствующей флоры,например бактерий, питательные среды следует подкислять либо добавлять к ним антибиотики. Для этих целей используют соляную, серную, лимонную, фосфорную кислоты. Кислоты к средам добавляют до тех пор, пока рН пробной порции не достигнет значений 4,2—4,5. Более высокая кислотность может оказывать угнетающее действие на рост многих грибов. Среды обычно подкисляют перед добавлением агар-агара. Некоторые кислоты, например лимонную, добавляют после стерилизации, причем на каждые 5 мл среды прибавляют 1 каплю 50%-ного раствора кислоты. Кислоты можно заменить бенгальской розовой (кислотный ксантеновый краситель) в концентрации 1 : 15 000 [692] или антибиотиками. Применяют следующую дозировку антибиотиков: 1 000 000 ед. пенициллина растворяют в 10 мл стерильной дистиллированной воды и к каждому литру питательной среды добавляют 2 мл полученного раствора; 1 000 000 ед. стрептомицина растворяют в 90 мл стерильной дистиллированной воды, после чего 4 мл раствора прибавляют к 1 л питательной среды. Антибиотики добавляют к питательным средам после автоклавирования.
Грибы изолируют из почв на питательные среды разными методами. Один из наиболее простых — метод почвенных разведений Ваксмана, заключающийся в посеве почвенной суспензии на питательные среды. Этим методом пользуется большинство микологов. Анализ микрофлоры почв методом почвенных разведений осуществляют следующим образом. Образцы почв, отобранные в зоне корневой системы растений (ризосфера) или на участках, лишенных растительности, просевают через сито с отверстиями диаметром не более 4 мм между двумя листами стерильной бумаги. Затем между этими же листами бумаги смешивают образцы 2—3 проб и быстро готовят среднюю пробу. Обеспечивая максимум стерильности, смешанную почву взвешивают на технических весах, обычно по 10 г, в 3—4 повторностях, насыпая ее на стерильные кружки бумаги шпателем. Для каждого образца берут новый кружок бумаги, а шпатель обмывают водой, вытирают насухо, погружают в банку со спиртом и обжигают, проводя через пламя горелки. Навески почвы переносят в предварительно подписанные стерильные колбы содержащие по 90 мл стерильной воды, и в течение 5 мин встряхивают. Далее 1 мл суспензии переносят из колбы в стерильную пробирку с 9 мл стерильной воды и слегка взбалтывают. Таким же образом 1 мл суспензии из этой пробирки переносят в следующую пробирку и т. д. Из пробирки третьего или четвертого разведения 1 мл суспензии высевают в стерильные чашки Петри. Посев из каждой пробирки производят в 3 или 4 чашки. Затем в чашки Петри стерильно (над пламенем горелки) наливают по 10 мл расплавленной, охлажденной до 40° С агаризованной питательной среды, после чего ее перемешивают осторожным покачиванием, прежде чем остынет агар, и ставят в термостат для инкубации при температуре 23—25° С на 10—15 сутки. Для более полного выявления видового состава почвенных грибов следует применять несколько различных агаризованных питательных сред, в том числе и сред, предусматривающих изолирование определенных экологических групп грибов. Засеянные водно-почвенной суспензией чашки Петри периодически просматривают, обычно начиная с третьих суток, и отдельные колонии грибов в случае их интенсивного разрастания отвивают в пробирки на агаризованную питательную среду. Окончательный учет проводят через 10—15 суток. При этом подсчитывают общее число выросших колоний, условно допуская, что каждая колония образовалась из одной споры или клетки гифы. Учет изолированных грибных зародышей (спор, фрагментов гиф) изложен ниже. Метод почвенных разведений Ваксмана удобен для характеристики грибной флоры почв разных типов, почв различных растительных ассоциаций, изучения влияния удобрений или других агротехнических мероприятий на видовой состав грибов.
Метод прямого посева почвы
Для выделения грибов методом прямого посева небольшие образцы почвы (0,005—0,015 г) берут из средней пробы стерильным ланцетом и смешивают с каплей стерильной воды на дне чашки Петри. В эту же чашку добавляют 8—10 мл охлажденной агаризованной питательной среды и частицы почвы равномерно распределяют по всей поверхности легким покачиванием чашки.
Метод прямых отпечатков почвенной пробы
Край пенополиуретанового цилиндра длиной 40 мм и диаметром 15 мм увлажняют агаризованной питательной средой, путем соприкосновения с ее поверхностью. Затем увлажненный край цилиндра прижимают к подсушенному почвенному образцу и этим же краем делают 10 последовательных отпечатков на поверхности питательной среды в чашках Петри, которые ставят в термостат для инкубации. Метод прямых отпечатков почвенной пробы прост и легко выполним.
Электростатический метод выделения грибов
Метод основан на способности диэлектриков притягивать положительно заряженные мелкие частицы. Для этого из фторопласта изготовляют круглые пластинки диаметром 4 см, обрабатывают их антисептиком — метиловым спиртом, избыток которого удаляют стерильной фильтровальной бумагой. Подсушенные пластинки электризуют трением о стерильную фильтровальную бумагу. Наэлектризованные пластинки подносят к рассыпанному ровным слоем почвенному образцу не ближе 2—3 см, чтобы избежать притяжения крупных частиц. Притянутые к пластинкам мельчайшие частицы отпечатывают на агари-зованных средах в чашках Петри. Электростатический метод дает возможность изолировать значительно большее число видов грибов, чем метод почвенных разведений.
Метод выделения грибов на растительные остатки
Метод выращивания грибов в условиях, приближенных к естественным . Измельченную стерню злаковых, головки цветков клевера и т. п. помещают в чашки Петри на увлажненную фильтровальную бумагу и стерилизуют. Затем на них высевают исследуемую почву и по мере появления колоний грибов отвивают последние на питательные среды. Метод предусматривает обнаружение в почвах многих медленнорастущих грибов, в том числе и сумчатых.
Метод фумигации почвы
Этим методом рекомендуют изолировать сумчатые грибы. Он основан на применении веществ, обладающих значительной токсичностью и летучестью — формалин, метилбромид, хлорпикрин и др. Пары указанных ядохимикатов легко диффундируют в исследуемые образцы и вместе с тем быстро могут быть удалены из них проветриванием. Просеянную через сито почву помещают в стеклянную трубку, на поверхности которой имеется несколько отверстий. В трубку вводят нужную дозу ядохимиката и все отверстия закрывают резиновыми пробками, которые после нескольких часов экспозиции заменяют ватными. Обработанную таким способом почву высевают на агаризован-ную питательную среду. Дозировка ядохимиката и экспозиция зависят главным образом от типа почвы и вида гриба. Например, виды Sorda-ria Ces. et de Not. и Thielavia Zopf из песчаной почвы лучше всего выделяются при обработке ее метилбромидом в концентрации 0,6 мл на 1000 мг почвы с экспозицией 4 ч, а виды Chaetomium Kunzeex Fr.— при концентрации 0,6—0,8 мл.
Метод тепловой обработки почвы
Сумчатые грибы можно выделять также методом тепловой обработки почвы. Образцы почв прогревают паром при 60—65° С в течение 30 мин, помещают на агаризованную питательную среду непосредственно или выделяют грибы методом почвенных разведений Ваксмана. Методы выделения темноцветных гифомицетов посредством облучения УФ-лучами почвенной суспензии и грибов с крупными спорами посредством центрифугирования почвы трудоемки, требуют специального оборудования, ввиду чего ими редко пользуются.
Метод приманки
Приманки применяют для обнаружения в почве видов, которые не изолируются на питательные среды из-за угнетения их быстрорастущей флорой и выделения некоторых экологических групп грибов. В качестве приманки используют семена конопли, крылья насекомых, экскременты крыс, мышей, кроликов, рога и копыта животных, перья птиц и т. п. Суть этого метода заключается в следующем. Почву слегка увлажняют и рассыпают по дну стерильной чашки Петри. Затем сверху раскладывают простерилизованный субстрат — приманку. После чего чашки Петри помещают во влажную камеру, периодически просматривают и появившуюся грибницу отвивают в пробирки на питательную среду. Для выделения из почв копрофильных грибов обычно используют экскременты животных, кератиноразрушающие грибы изолируют на обезжиренный стерильный волос, виды рода Fusarium — на стерильные ломтики картофеля. Обитающие в почве хитридиевые, сапролег-ниевые и другие грибы, образующие зооспоры, чаще всего выделяют на семена конопли, кусочки вареных яиц, мертвых насекомых и т. д. Осуществляют это следующим образом. В стерильные чашки Петри кладут по 10 г исследуемой почвы, заливают стерильной водой, добавляют приманку (желательно несколько разных видов) и ставят в термостат для инкубации. Другая группа методов предусматривает применение стеклотехники разной степени сложности для обнаружения и выделения грибов, находящихся в почве в активном состоянии. К ним относятся метод обрастания стекол Холодного, метод предметных стекол-ловушек Ля-Туш, методы решетчатых экранизирующих погруженных пластинок, капиллярных педоскопов, погруженных (иммерсионных) трубок Честерса. Кроме того, имеется ряд модификаций указанных выше методов, которые содержат лишь частичные видоизменения и сводятся в основном к покрытию разного рода стеклянных устройств питательной средой. Суть этих методов сводится к тому, чтобы в отверстия в стеклянных устройствах разной степени сложности смог проникнуть растущий мицелий гриба. Ввиду того что всеми перечисленными выше методами можно выполнить сравнительно небольшой объем работы и они не позволяют изолировать и идентифицировать отдельные виды грибов, мы на них не останавливаемся.
Выделение грибов с корней растений и других растительных остатков
Метод водных смывов
Большинство почвенных грибов аккумулируется вблизи корней растений. С поверхности корней растений и почвы, находящейся в непосредственной близости от них, грибы обычно изолируют методом водных смывов. Этот метод пригоден и для выделения грибов с поверхности опавших листьев, валежника и других растительных остатков. С корней или других растительных остатков осторожно стряхивают почву, ножницами, предварительно погруженными в банку со спиртом и обожженными над пламенем горелки, разрезают корни на отрезки 3—5 см, которые стерильным пинцетом переносят (обычно по 3—4 отрезка) в заранее подписанные колбы, содержащие по 100 мл стерильной воды, и встряхивают в течение 5 мин. Затем по 1 мл полученной суспензии высевают в чашки, предварительно приготовив нужное разведение. Суспензию 3-го или 4-го разведения разливают в 3 или 4 чашки Петри по 1 мл в каждую, заливают расплавленной, но охлажденной агаризованной питательной средой и перемешивают легкими покачиваниями до остывания агара. После этого чашки Петри ставят в термостат для инкубации. Оставшуюся в колбе водную суспензию почвы осторожно отфильтровывают через предварительно взвешенный и надписанный бумажный фильтр, который высушивают до постоянной массы для определения сухой массы почвы, смытой с поверхности корней. В колбу с корнями повторно вливают 100 мл стерильной воды, с которой поступают так же, как и с первой порцией. Обычно делают 5—10 смывов. На питательные среды в чашки Петри чаще всего высевают разведения 1-го, 5-го и 10-го смывов. Основная масса грибных зародышей отделяется с корней в первые смывы. После 10 смывов грибных зародышей на поверхности корней остается мало.
Метод водных смывов с растительных остатков прост, удобен и позволяет без особого труда выделять большое количество грибов разных видов.
Метод получения спор сухоспоровых сумчатых грибов
Выделение в чистые культуры аскоспор сумчатых грибов, плодовые тела которых развиваются на поверхности или внутри растительных и каких-либо других тканей, например на корнях растений, затруднено сильным инфицированием образцов бактериями, сапрофитными быстрорастущими грибами и другими организмами. Стерилизация образцов химическими веществами или пламенем, как правило, убивает и исследуемые объекты, а многоразовая промывка стерильной водой обычно не дает желательных результатов. Предложен метод получения спор сухоспоровых сумчатых грибов с последующим перенесением их на питательные среды, рассчитанный на виды грибов с активным спороотделением, плодовые тела которых снабжены отверстием. Этим методом можно получать также споры базидиальных грибов с открытым гименофором и односпоровые культуры разных видов грибов. Метод не пригоден для выделения грибов, споры которых погружены в слизь или плодовые тела лишены отверстия. Для проведения опыта необходимо брать свежие образцы со зрелыми плодовыми телами. Поверхность образцов (корни, листья или другие объекты) осторожно очищают от растительных остатков и частичек почвы стерильным пинцетом. На дно стерильных чашек Петри или Коха диаметром 10—18 см ставят несколько маленьких чашечек для тканевых культур диаметром 4—5 см, сняв предварительно с них крышки (крышки маленьких чашечек можно разместить в других больших чашках). Маленьких чашечек ставят столько, сколько может поместиться в больших. Исследуемые образцы с плодоношениями грибов (корни, листья, стебли растений) кладут так, чтобы каждый образец лежал на краях маленьких чашечек, не дотрагиваясь до дна, для предохранения его от засорения. При этом плодовые тела аскомицетов обязательно должны располагаться отверстиями вниз. Экскременты животных следует раскладывать на стерильную сетку с крупными отверстиями — металлическую или лучше волосяную, положенную на чашечки. Образцы накрывают 2—3 слоями кружков или полосок стерильной фильтровальной бумаги, увлажненной стерильной водой из пипетки. Чашку Коха или Петри накрывают крышкой. Параллельно закладывают опыт без увлажнения фильтровальной бумаги, но для повышения относительной влажности воздуха в одну из чашечек наливают стерильную воду. Если маленьких чашечек для тканевых культур нет,можно использовать стерильные предметные стекла. В этом случае на дно больших чашек кладут предметные стекла, на которые помещают стерильнбш палочки, а на них — исследуемые образцы. Рекомендуется использовать стеклянные палочки. Наносить тонкий слой питательной среды на дно маленьких чашечек или на предметные стекла нежелательно, потому что на нее могут попасть споры быстрорастущих грибов, засоряющие поверхность. Через определенный промежуток времени (3—48 ч, в зависимости от целей опыта) снимают крышку чашки Коха или Петри, вынимают маленькие чашечки, ставят их на столик микроскопа и под малым увеличением находят одиночные споры. Под эти же образцы можно помещать другие маленькие чашечки, повторяя процесс несколько раз, если нас интересует продолжительность высыпания спор с плодовых тел. Затем иглу прокаливают над огнем, охлаждают, погружая в питательную среду, и под контролем микроскопа, коснувшись увлажненным кончиком иглы поверхности споры, переносят ее на питательную среду в пробирку или чашку Петри. Вокруг спор часто образуются капли воды, которые необходимо удалить, так как взять споры на кончик иглы с капли воды трудно. Для этого чашки со спорами на несколько минут оставляют открытыми под стеклянным колпаком. При выделении спор базидиальных грибов с открытым гименофором плодовые тела или частички плодовых тел кладут гименофором вниз на края маленьких чашечек, а в одну из чашечек наливают воду. Если плодовые тела базидиальных грибов большие, то чашки Петри или Коха накрывают не крышками, а стеклянным колпаком или цилиндром. Маленькие плодовые тела раскладывают на сетку. Гименофор мягких плодовых тел не должен сминаться. Ножку плодовых тел перед закладыванием опыта необходимо удалить. Предложенный метод можно использовать для получения односпо-ровых культур гифальных грибов, у которых споры опадают пассивно, особенно видов Penicillium, Aispergillus и др. Грибы выращивают на питательных средах в чашках Петри крышкой вниз. На дно крышки ставят открытые маленькие чашечки или предметные стекла. После того как образуются колонии и спороношение грибов, чашку необходимо слегка встряхнуть, чтобы споры упали в чашечки. Споры стерильно иглой переносят на питательную среду, под малым увеличением микроскопа.
Почвенные грибы — обширная и сложная экологическая группа организмов. Среди них имеются представители, поражающие насекомых, нематод, корни растений; многие виды развиваются на экскрементах животных, растительных остатках; известны грибы-микоризообразователи. Таким образом, большинству грибов, обитающих в почвах, свойственна приуроченность к определенному субстрату. Эту особенность широко используют микологи при выделении некоторых видов и групп грибов в чистые культуры на питательные среды. Предложено большое количество питательных сред, содержащих различные источники углерода и азота.
Выделение грибов из почвы
Для выделения грибов из почв обычно используют твердые (агаризованные) питательные среды с легкодоступными источниками углерода — сахарозой, глюкозой, декстрозой. К таким средам относятся агаризованная среда Чапека, картофельнодекстрозныи агар, агаризованное пивное сусло. С помощью этих питательных сред обнаруживают и учитывают в основном быстрорастущие и обильноспороносящие таксоны (виды Penicillium Link ex Fr., Aspergillus Micheli ex Fr. и др.).
Выделение грибов на селективные среды
При экологическом анализе микофлоры почв, т. е. учете грибов, приуроченных к определенным субстратам, применяют разные селективные питательные среды. Так, целлюлозоразрушающие грибы изолируют на питательные среды, содержащие целлюлозу (фильтровальную бумагу) или же синтетические среды с целлюлозой либо карбоксиметил-целлюлозой. Для выделения грибов на фильтровальную бумагу последнюю нарезают полосками, складывают продольными складками («гармошкой») и помещают в пробирки. Потом в каждую пробирку добавляют 2—3 мл жидкой среды Чапека или Гетчинсона без источника углерода и стерилизуют 30 мин при температуре 115° С. Грибы, способные разлагать лигнин, изолируют на питательные среды с лигнином. Для обнаружения в почве грибов, принимающих участие в разложении гумуса, к питательным средам прибавляют в качестве источника углерода и азота гуматнатрия. Эти же грибы можно выделять и на почвенный агар — вытяжку почвы с агаром. Для этого необходимое количество воздушно-сухой измельченной почвы (например, 500 г) заливают водой (1 л), настаивают сутки периодически взбалтывая, затем кипятят 30 мин и фильтруют через 1—2 слоя фильтровальной бумаги, после чего восстанавливают прежний объем жидкости, устанавливают нужный уровень рН однозамещенным фосфорнокислым калием, добавляют агар-агар (15—20 г), разливают в посуду и стерилизуют. Грибы, которые могут расти в условиях дефицита органических веществ, выделяют на голодный агар, который готовят из расчета 15—20 г агар-агара на 1 л воды. Предложены также питательные среды, предусматривающие выявление в почве определенных групп грибов. Так, например, виды Fusarium Link, ex Fr. выделяют на агаризованную среду, содержащую пентахлорнитробензол (0,5 г на 1 л среды). В почвах грибы находятся в ассоциациях с другими организмами. Поэтому для подавления роста некоторой сопутствующей флоры,например бактерий, питательные среды следует подкислять либо добавлять к ним антибиотики. Для этих целей используют соляную, серную, лимонную, фосфорную кислоты. Кислоты к средам добавляют до тех пор, пока рН пробной порции не достигнет значений 4,2—4,5. Более высокая кислотность может оказывать угнетающее действие на рост многих грибов. Среды обычно подкисляют перед добавлением агар-агара. Некоторые кислоты, например лимонную, добавляют после стерилизации, причем на каждые 5 мл среды прибавляют 1 каплю 50%-ного раствора кислоты. Кислоты можно заменить бенгальской розовой (кислотный ксантеновый краситель) в концентрации 1 : 15 000 [692] или антибиотиками. Применяют следующую дозировку антибиотиков: 1 000 000 ед. пенициллина растворяют в 10 мл стерильной дистиллированной воды и к каждому литру питательной среды добавляют 2 мл полученного раствора; 1 000 000 ед. стрептомицина растворяют в 90 мл стерильной дистиллированной воды, после чего 4 мл раствора прибавляют к 1 л питательной среды. Антибиотики добавляют к питательным средам после автоклавирования.
Метод почвенных разведений
Грибы изолируют из почв на питательные среды разными методами. Один из наиболее простых — метод почвенных разведений Ваксмана, заключающийся в посеве почвенной суспензии на питательные среды. Этим методом пользуется большинство микологов. Анализ микрофлоры почв методом почвенных разведений осуществляют следующим образом. Образцы почв, отобранные в зоне корневой системы растений (ризосфера) или на участках, лишенных растительности, просевают через сито с отверстиями диаметром не более 4 мм между двумя листами стерильной бумаги. Затем между этими же листами бумаги смешивают образцы 2—3 проб и быстро готовят среднюю пробу. Обеспечивая максимум стерильности, смешанную почву взвешивают на технических весах, обычно по 10 г, в 3—4 повторностях, насыпая ее на стерильные кружки бумаги шпателем. Для каждого образца берут новый кружок бумаги, а шпатель обмывают водой, вытирают насухо, погружают в банку со спиртом и обжигают, проводя через пламя горелки. Навески почвы переносят в предварительно подписанные стерильные колбы содержащие по 90 мл стерильной воды, и в течение 5 мин встряхивают. Далее 1 мл суспензии переносят из колбы в стерильную пробирку с 9 мл стерильной воды и слегка взбалтывают. Таким же образом 1 мл суспензии из этой пробирки переносят в следующую пробирку и т. д. Из пробирки третьего или четвертого разведения 1 мл суспензии высевают в стерильные чашки Петри. Посев из каждой пробирки производят в 3 или 4 чашки. Затем в чашки Петри стерильно (над пламенем горелки) наливают по 10 мл расплавленной, охлажденной до 40° С агаризованной питательной среды, после чего ее перемешивают осторожным покачиванием, прежде чем остынет агар, и ставят в термостат для инкубации при температуре 23—25° С на 10—15 сутки. Для более полного выявления видового состава почвенных грибов следует применять несколько различных агаризованных питательных сред, в том числе и сред, предусматривающих изолирование определенных экологических групп грибов. Засеянные водно-почвенной суспензией чашки Петри периодически просматривают, обычно начиная с третьих суток, и отдельные колонии грибов в случае их интенсивного разрастания отвивают в пробирки на агаризованную питательную среду. Окончательный учет проводят через 10—15 суток. При этом подсчитывают общее число выросших колоний, условно допуская, что каждая колония образовалась из одной споры или клетки гифы. Учет изолированных грибных зародышей (спор, фрагментов гиф) изложен ниже. Метод почвенных разведений Ваксмана удобен для характеристики грибной флоры почв разных типов, почв различных растительных ассоциаций, изучения влияния удобрений или других агротехнических мероприятий на видовой состав грибов.
Метод прямого посева почвы
Для выделения грибов методом прямого посева небольшие образцы почвы (0,005—0,015 г) берут из средней пробы стерильным ланцетом и смешивают с каплей стерильной воды на дне чашки Петри. В эту же чашку добавляют 8—10 мл охлажденной агаризованной питательной среды и частицы почвы равномерно распределяют по всей поверхности легким покачиванием чашки.
Метод прямых отпечатков почвенной пробы
Край пенополиуретанового цилиндра длиной 40 мм и диаметром 15 мм увлажняют агаризованной питательной средой, путем соприкосновения с ее поверхностью. Затем увлажненный край цилиндра прижимают к подсушенному почвенному образцу и этим же краем делают 10 последовательных отпечатков на поверхности питательной среды в чашках Петри, которые ставят в термостат для инкубации. Метод прямых отпечатков почвенной пробы прост и легко выполним.
Электростатический метод выделения грибов
Метод основан на способности диэлектриков притягивать положительно заряженные мелкие частицы. Для этого из фторопласта изготовляют круглые пластинки диаметром 4 см, обрабатывают их антисептиком — метиловым спиртом, избыток которого удаляют стерильной фильтровальной бумагой. Подсушенные пластинки электризуют трением о стерильную фильтровальную бумагу. Наэлектризованные пластинки подносят к рассыпанному ровным слоем почвенному образцу не ближе 2—3 см, чтобы избежать притяжения крупных частиц. Притянутые к пластинкам мельчайшие частицы отпечатывают на агари-зованных средах в чашках Петри. Электростатический метод дает возможность изолировать значительно большее число видов грибов, чем метод почвенных разведений.
Метод выделения грибов на растительные остатки
Метод выращивания грибов в условиях, приближенных к естественным . Измельченную стерню злаковых, головки цветков клевера и т. п. помещают в чашки Петри на увлажненную фильтровальную бумагу и стерилизуют. Затем на них высевают исследуемую почву и по мере появления колоний грибов отвивают последние на питательные среды. Метод предусматривает обнаружение в почвах многих медленнорастущих грибов, в том числе и сумчатых.
Метод фумигации почвы
Этим методом рекомендуют изолировать сумчатые грибы. Он основан на применении веществ, обладающих значительной токсичностью и летучестью — формалин, метилбромид, хлорпикрин и др. Пары указанных ядохимикатов легко диффундируют в исследуемые образцы и вместе с тем быстро могут быть удалены из них проветриванием. Просеянную через сито почву помещают в стеклянную трубку, на поверхности которой имеется несколько отверстий. В трубку вводят нужную дозу ядохимиката и все отверстия закрывают резиновыми пробками, которые после нескольких часов экспозиции заменяют ватными. Обработанную таким способом почву высевают на агаризован-ную питательную среду. Дозировка ядохимиката и экспозиция зависят главным образом от типа почвы и вида гриба. Например, виды Sorda-ria Ces. et de Not. и Thielavia Zopf из песчаной почвы лучше всего выделяются при обработке ее метилбромидом в концентрации 0,6 мл на 1000 мг почвы с экспозицией 4 ч, а виды Chaetomium Kunzeex Fr.— при концентрации 0,6—0,8 мл.
Метод тепловой обработки почвы
Сумчатые грибы можно выделять также методом тепловой обработки почвы. Образцы почв прогревают паром при 60—65° С в течение 30 мин, помещают на агаризованную питательную среду непосредственно или выделяют грибы методом почвенных разведений Ваксмана. Методы выделения темноцветных гифомицетов посредством облучения УФ-лучами почвенной суспензии и грибов с крупными спорами посредством центрифугирования почвы трудоемки, требуют специального оборудования, ввиду чего ими редко пользуются.
Метод приманки
Приманки применяют для обнаружения в почве видов, которые не изолируются на питательные среды из-за угнетения их быстрорастущей флорой и выделения некоторых экологических групп грибов. В качестве приманки используют семена конопли, крылья насекомых, экскременты крыс, мышей, кроликов, рога и копыта животных, перья птиц и т. п. Суть этого метода заключается в следующем. Почву слегка увлажняют и рассыпают по дну стерильной чашки Петри. Затем сверху раскладывают простерилизованный субстрат — приманку. После чего чашки Петри помещают во влажную камеру, периодически просматривают и появившуюся грибницу отвивают в пробирки на питательную среду. Для выделения из почв копрофильных грибов обычно используют экскременты животных, кератиноразрушающие грибы изолируют на обезжиренный стерильный волос, виды рода Fusarium — на стерильные ломтики картофеля. Обитающие в почве хитридиевые, сапролег-ниевые и другие грибы, образующие зооспоры, чаще всего выделяют на семена конопли, кусочки вареных яиц, мертвых насекомых и т. д. Осуществляют это следующим образом. В стерильные чашки Петри кладут по 10 г исследуемой почвы, заливают стерильной водой, добавляют приманку (желательно несколько разных видов) и ставят в термостат для инкубации. Другая группа методов предусматривает применение стеклотехники разной степени сложности для обнаружения и выделения грибов, находящихся в почве в активном состоянии. К ним относятся метод обрастания стекол Холодного, метод предметных стекол-ловушек Ля-Туш, методы решетчатых экранизирующих погруженных пластинок, капиллярных педоскопов, погруженных (иммерсионных) трубок Честерса. Кроме того, имеется ряд модификаций указанных выше методов, которые содержат лишь частичные видоизменения и сводятся в основном к покрытию разного рода стеклянных устройств питательной средой. Суть этих методов сводится к тому, чтобы в отверстия в стеклянных устройствах разной степени сложности смог проникнуть растущий мицелий гриба. Ввиду того что всеми перечисленными выше методами можно выполнить сравнительно небольшой объем работы и они не позволяют изолировать и идентифицировать отдельные виды грибов, мы на них не останавливаемся.
Выделение грибов с корней растений и других растительных остатков
Метод водных смывов
Большинство почвенных грибов аккумулируется вблизи корней растений. С поверхности корней растений и почвы, находящейся в непосредственной близости от них, грибы обычно изолируют методом водных смывов. Этот метод пригоден и для выделения грибов с поверхности опавших листьев, валежника и других растительных остатков. С корней или других растительных остатков осторожно стряхивают почву, ножницами, предварительно погруженными в банку со спиртом и обожженными над пламенем горелки, разрезают корни на отрезки 3—5 см, которые стерильным пинцетом переносят (обычно по 3—4 отрезка) в заранее подписанные колбы, содержащие по 100 мл стерильной воды, и встряхивают в течение 5 мин. Затем по 1 мл полученной суспензии высевают в чашки, предварительно приготовив нужное разведение. Суспензию 3-го или 4-го разведения разливают в 3 или 4 чашки Петри по 1 мл в каждую, заливают расплавленной, но охлажденной агаризованной питательной средой и перемешивают легкими покачиваниями до остывания агара. После этого чашки Петри ставят в термостат для инкубации. Оставшуюся в колбе водную суспензию почвы осторожно отфильтровывают через предварительно взвешенный и надписанный бумажный фильтр, который высушивают до постоянной массы для определения сухой массы почвы, смытой с поверхности корней. В колбу с корнями повторно вливают 100 мл стерильной воды, с которой поступают так же, как и с первой порцией. Обычно делают 5—10 смывов. На питательные среды в чашки Петри чаще всего высевают разведения 1-го, 5-го и 10-го смывов. Основная масса грибных зародышей отделяется с корней в первые смывы. После 10 смывов грибных зародышей на поверхности корней остается мало.
Метод водных смывов с растительных остатков прост, удобен и позволяет без особого труда выделять большое количество грибов разных видов.
Метод получения спор сухоспоровых сумчатых грибов
Выделение в чистые культуры аскоспор сумчатых грибов, плодовые тела которых развиваются на поверхности или внутри растительных и каких-либо других тканей, например на корнях растений, затруднено сильным инфицированием образцов бактериями, сапрофитными быстрорастущими грибами и другими организмами. Стерилизация образцов химическими веществами или пламенем, как правило, убивает и исследуемые объекты, а многоразовая промывка стерильной водой обычно не дает желательных результатов. Предложен метод получения спор сухоспоровых сумчатых грибов с последующим перенесением их на питательные среды, рассчитанный на виды грибов с активным спороотделением, плодовые тела которых снабжены отверстием. Этим методом можно получать также споры базидиальных грибов с открытым гименофором и односпоровые культуры разных видов грибов. Метод не пригоден для выделения грибов, споры которых погружены в слизь или плодовые тела лишены отверстия. Для проведения опыта необходимо брать свежие образцы со зрелыми плодовыми телами. Поверхность образцов (корни, листья или другие объекты) осторожно очищают от растительных остатков и частичек почвы стерильным пинцетом. На дно стерильных чашек Петри или Коха диаметром 10—18 см ставят несколько маленьких чашечек для тканевых культур диаметром 4—5 см, сняв предварительно с них крышки (крышки маленьких чашечек можно разместить в других больших чашках). Маленьких чашечек ставят столько, сколько может поместиться в больших. Исследуемые образцы с плодоношениями грибов (корни, листья, стебли растений) кладут так, чтобы каждый образец лежал на краях маленьких чашечек, не дотрагиваясь до дна, для предохранения его от засорения. При этом плодовые тела аскомицетов обязательно должны располагаться отверстиями вниз. Экскременты животных следует раскладывать на стерильную сетку с крупными отверстиями — металлическую или лучше волосяную, положенную на чашечки. Образцы накрывают 2—3 слоями кружков или полосок стерильной фильтровальной бумаги, увлажненной стерильной водой из пипетки. Чашку Коха или Петри накрывают крышкой. Параллельно закладывают опыт без увлажнения фильтровальной бумаги, но для повышения относительной влажности воздуха в одну из чашечек наливают стерильную воду. Если маленьких чашечек для тканевых культур нет,можно использовать стерильные предметные стекла. В этом случае на дно больших чашек кладут предметные стекла, на которые помещают стерильнбш палочки, а на них — исследуемые образцы. Рекомендуется использовать стеклянные палочки. Наносить тонкий слой питательной среды на дно маленьких чашечек или на предметные стекла нежелательно, потому что на нее могут попасть споры быстрорастущих грибов, засоряющие поверхность. Через определенный промежуток времени (3—48 ч, в зависимости от целей опыта) снимают крышку чашки Коха или Петри, вынимают маленькие чашечки, ставят их на столик микроскопа и под малым увеличением находят одиночные споры. Под эти же образцы можно помещать другие маленькие чашечки, повторяя процесс несколько раз, если нас интересует продолжительность высыпания спор с плодовых тел. Затем иглу прокаливают над огнем, охлаждают, погружая в питательную среду, и под контролем микроскопа, коснувшись увлажненным кончиком иглы поверхности споры, переносят ее на питательную среду в пробирку или чашку Петри. Вокруг спор часто образуются капли воды, которые необходимо удалить, так как взять споры на кончик иглы с капли воды трудно. Для этого чашки со спорами на несколько минут оставляют открытыми под стеклянным колпаком. При выделении спор базидиальных грибов с открытым гименофором плодовые тела или частички плодовых тел кладут гименофором вниз на края маленьких чашечек, а в одну из чашечек наливают воду. Если плодовые тела базидиальных грибов большие, то чашки Петри или Коха накрывают не крышками, а стеклянным колпаком или цилиндром. Маленькие плодовые тела раскладывают на сетку. Гименофор мягких плодовых тел не должен сминаться. Ножку плодовых тел перед закладыванием опыта необходимо удалить. Предложенный метод можно использовать для получения односпо-ровых культур гифальных грибов, у которых споры опадают пассивно, особенно видов Penicillium, Aispergillus и др. Грибы выращивают на питательных средах в чашках Петри крышкой вниз. На дно крышки ставят открытые маленькие чашечки или предметные стекла. После того как образуются колонии и спороношение грибов, чашку необходимо слегка встряхнуть, чтобы споры упали в чашечки. Споры стерильно иглой переносят на питательную среду, под малым увеличением микроскопа.
