Выделение из корней
Свежевыкопанные корни многократно промывают стерильной водой, отжимают в нескольких слоях стер'ильной фильтровальной бумаги, отрезками длиной 1—3 см или целиком (у проростков) укладывают на кружки стерильной фильтровальной бумаги в чашках Петри и ставят в термостат при температуре 26° С. Наблюдение за ростом грибов и их выделение производят через 24—48 ч и в последующие дни роста.
Относительную плотность заселения мицелия и численность грибов в прикорневой почве определяют путем растирания определенной навески после многократного смыва стерильной водой. Навеску свежевыделенных корней с приставшими к ним частицами почвы помещают в колбочку со стерильной водой, взбалтывают для освобождения корней от частиц почвы. После многократного промывания водой корни вынимают микологическим крючком, а взвесь почвенных частиц в воде фильтруют и взвешивают для определения массы почвы, приставшей к корням. По разнице между первоначальной навеской и массой почвы определяют массу корней. Смывы в определенном разведении высевают на кислый сусловый агар для определения численности и состава видов грибов в прикорневой почве. Растертые корни мерно высевают на кислый сусловый агар, подсчитывают число колоний и выделяют культуры. Плотность заселения определяют также на определенной поверхности.
Скальпелем, прокаленным над пламенем горелки, делают срез поверхностной ткани по направлению от здоровой части к пораженной. На границе больной и здоровой ткани отрезают небольшой кусочек и переносят в пробирку с кислым сусловым агаром.
Выделение из сосудистой системы
Стебли и корни отмывают от почвы, стерилизуют поверхностно, прокаленным скальпелем разрезают стебель поперек на расстоянии 5— 15 см от корневой шейки и небольшой участок пораженного, побуревшего сосуда высевают на поверхность кислого суслового агара; отдельные кусочки ткани помещают во влажную камеру.
Выделение из стеблей и листьев
В ряде случаев грибы можно выделить не только из свежего материала, но и из гербарных образцов. Необходимым условием при сборе для этих целей является немедленная фиксация гербарного материала высушиванием, а также предохранение от заражения посторонней микофло-рой. Наиболее приемлемый метод приготовления гербарного материала — немедленное помещение листьев, стеблей или их частей в стерильный пакет из фильтровальной бумаги и высушивание их в этом пакете. После высушивания листьев пакет помещают во второй пакет, также стерильный, но из более плотной бумаги. В таком виде материал можно хранить до исследования. Материал помещают во влажную камеру, образцы просматривают под бинокулярной лупой. Выделение грибов производят через сутки и более.
Выделение из зерна хлебных злаков и семян
При выделении видов грибов, развивающихся во внутренних тканях зерна или семян, пользуются в основном методом влажной камеры. Зерна или семена после поверхностной дезинфекции укладывают на поверхность фильтровальной бумаги с интервалом 0,5—1,0 см; из одной исследуемой партии зерна среднего образца берут 100—1000 зерен. При этом следует принимать во внимание зараженность грибами и их пораженность. Зараженность определяют числом грибных зародышей в определенном количестве зерна; пораженность характеризуется степенью роста тех или иных видов грибов и поражения ими исследуемого субстрата. Зараженность определяют путем посева смыва определенной навески зерна или семян и последующего пересчета количества грибных организмов на единицу массы зерна.
Выделение из клубней, луковиц, корнеплодов
Выделение производят непосредственно из исследуемого материала либо после накопления на тканях этих органов мицелия грибов или их спороношения во влажной камере. В том и другом случае необходима поверхностная стерилизация и предварительный отмыв исследуемого материала от частиц почвы. При непосредственном выделении срезают стерильно небольшой кусочек на границе пораженной и здоровой ткани и помещают его на кислый сусловый агар. Для посевов делают серию срезов из разных мест здоровой и в разной степени пораженной ткани.
Селективные, или «приманочные», методы
Для выделения паразитных фитопатогенных грибов, не растущих на обычных питательных средах, используют растения-индикаторы, чувствительные к поражению, культуру тканей или органов растений, проростки или семена и стерильные среды, приготовленные на их основе. Например, чистая культура Phytophthora infestans может быть выделена при культивировании на стерильной ткани клубня картофеля, Erysiphe graminis — на проростках ячменя, Puccinia graminis f. tri-cini — на проростках пшеницы в стадии 2—3 листьев. Моноспоровую культуру можно получить заражением ткани или растения каплей, содержащей одну спору.
Метод элективного выделения специфических видов
Метод заключается в погружении в почву чувствительных к специфическим видам стерильных или нестерильных частей растений с последующим изъятием их и микологическим анализом. В этом случае необходимо забирать анализы в разные сроки и помещать во влажную камеру для выделения грибов, осуществляющих первичное заселение погружаемых частей растений,
Метод «контактных стекол»
Метод выделения микроорганизмов непосредственно из места их расположения в почве (метод Росси — Холодного). Стерильные предметные стекла прижимают к трещинам свежей почвы. Через несколько дней стекла встряхивают для освобождения от крупных комочков почвы и помещают на поверхность агаровой среды в чашку Петри стороной, соприкасавшейся с почвой. Выросшие грибы просматривают под малым увеличением микроскопа и после определенного периода инкубации колонии переносят на свежую среду.
Поддержание чистых культур
После выделения культур и своевременной их очистки от посторонних организмов следует поддерживать чистые культуры в жизнеспособном состоянии. Простейший способ поддержания чистых культур — пересев их через определенное время в. пробирки на косяки свежей агаровой среды. Периодичность пересевов зависит от вида гриба и определяется временем его выживаемости. Следует учитывать, что длительное выращивание грибов на искусственных средах может привести к изменению их свойств, в частности к потере патогенности или снижению вирулентности.
Специализация фитопатогенных
Специализация фитопатогенных грибов — приуроченность их к определенному виду, сорту питающего растения, способность (приспособленность) к паразитированию на одном или нескольких видах, сортах. Филогенетическая специализация патогена — избирательная способность его к поражению определенного набора видов питающих растений. Возбудители болезней с широкой специализацией называются широкоспециализированными, например Sclerotinia sclerotiorum — возбудитель белой гнили разных культур, Botrytis cinerea — возбудитель серой гнили. К узкоспециализированным возбудителям относятся, например, головневые и ржавчинные грибы (Ustiiago, Puccinia) и др. Приуроченность патогена к определенным тканям или органам в пределах одного растения называется тканевой, или органотропной, специализацией (антракноз смородины — Gloeosporium ribis (Lib.) Mont, ot Desm.; мучнистая роса огурца—Erysiphe cicchorocearum; кила капусты — Plasmodiophora brassicae и др.). Возрастная онтогенетическая, или возрастно-физиологическая, специализация — это приуроченность гриба к поражению отдельного органа растения определенного возраста. Например, Sphaerotheca mors-uvae поражает мучнистой росой только верхушечные молодые листочки крыжовника.
Специализированные формы и расы
Наличие одинаковых морфологических признаков у паразитов, развивающихся на разных питающих растениях, не исключает существования между ними биологического отличия, заключающегося в приуроченности отдельных форм одного и того же паразита к определенным растениям. Так, например, у стеблевой ржавчины, вызываемой Puccinia graminis, известно 10 специализированных форм, у Fusarium oxy-sporum — свыше 80. Специализированные формы неоднородны и могут состоять из еще более узкоспециализированных физиологических рас. Расы различаются в пределах вида по узкой приуроченности к поражению определенного круга сортов. Физиологические расы определяются по их патогенности к определенным растениям и сортам-дифференциаторам, которые подбирают для отдельных возбудителей с учетом биологических особенностей питающего растения. Изменение вирулентности отдельных рас фитопатогенных грибов, утрата или приобретение ими патогенных свойств обусловливается амплитудой изменчивости грибов и их адаптацией к различным условиям. Постоянная смена расового состава паразитов в природе зависит от изменения набора возделываемых сортов. Процесс формирования новой расы гриба можно представить в виде двух последовательных этапов. Первый этап — это появление новой расы в результате полового процесса, мутаций, гетерокариозиса или парасексуального процесса. Новая раса становится деятельной при наличии восприимчивого сорта. Второй этап заключается в вытеснении менее вирулентных рас восприимчивых растений, стабилизации популяции новой расы патогена. Устойчивость растений сохраняется довольно продолжительное время — до максимального накопления и распространения вновь возникшей расы. Внутри физиологических рас различают биотипы, характеризующиеся способностью паразитировать на отдельных сортах. При изучении расового состава ряда специализированных видов грибов, в частности ржавчинных и головневых, возбудителей мучнистой росы злаков, фитофторы картофеля и томатов, рака картофеля и других болезней, используют наборы сортов-дифференциаторов, которые инокулируют спорами грибов и учитывают характер поражения по шкалам иммуности. В настоящее время для каждого специализированного возбудителя разработаны методики определения вирулентности по отношению к международному набору сортов-дифференциаторов. При оценке вирулентности рас к разным растениям пользуются следующими показателями: устойчивость (резистентность) — способность растений поражаться грибами в очень слабой степени; выносливость (толерантность) — способность больных растений не снижать продуктивность или снижать ее незначительно; восприимчивость — неспособность растения противостоять заражению и распространению патогена. Различают вертикальную устойчивость — к нескольким расам возбудителя — и горизонтальную (полевую) — ко всем расам паразита. Устойчивость проявляется в двух формах: аксении и защитной реакции. Аксения — устойчивость, существующая до заражения и препятствующая ему; обусловливается морфологическими, химическими, физиологическими или физиолого-морфологическими особенностями растения. Защитная реакция вырабатывается растением в процессе инокуляции.
Методы искусственного заражения
Приемы инокуляции растений довольно разнообразны и зависят от биологии гриба и роли инфекции в патогенезе заболевания, а также от целей исследования (проверка патогенности штаммов, оценка устойчивости сортов и т. п.). Инокуляцию проводят как патогеном, выросшим на искусственной питательной среде, так и спорами природной популяции гриба. Методы инокуляции растений весьма разнообразны. Для разных культур и заболеваний существуют разные методы создания инфекционного фона и способы заражения культур, общими условиями при которых является соблюдение чистых культур используемого изолята, стандартизация условий культивирования (среда, температура, густота посева, возраст и др.). Для получения сравнимых результатов и выяснения инфекционной нагрузки необходима количественная характеристика инокулюма: содержание разных видов спор (макроконидий, микроконидий, хламидоспор) в единице массы или объема используемой культуры. Споровый материал для заражения может быть получен из гербария естественно зараженного растения (головня, ржавчина, мучнистая роса) и при культивировании гриба. В первом случае споровый материал собирают в зависимости от способа спорообразования (плодовые тела базидиальных и сумчатых грибов, спорангиоспоры, конидии на мицелии, в спородохиях, коремиях, пикнидах и т. д.) и локализации гриба в растении на стерильную бумагу или в чашки Петри с соблюдением стерильности для предохранения загрязнения исходного материала вторичной микрофлорой. Плодовые тела или стерильно собранные споры переносят препаровальной иглой в стерильную пробирку или чашку с водой и, освободив споры от плодовых тел, получают взвесь спорового материала, а после удаления воды — сухой споровый материал. Заражение через почву для создания инфекционного фона включает следующие приемы: приготовление и стерилизацию почвы, заражение ее грибами и равномерное размешивание (учитывается количество конидий и хламидоспор в 1 г зараженной почвы), выращивание проростков здоровых растений, их посадку в сосуды с зараженной почвой. Затем сосуды равномерно увлажняют и помещают в камеры или вегетационный домик при соответствующей для данного вида растения температуре и освещении. Заражение семян осуществляется путем опыливания сухими спорами, опрыскивания водной взвесью конидий или погружением в нее семян незадолго до посева. Заражение поврежденных и неповрежденных тканей также производят взвесью конидий путем опрыскивания, нанесения кисточкой, опиливанием сухими конидиями или втиранием их массы. Для получения зараженных семян инокулируют цветы. Заражение через сосудистую систему производят введением шприцем взвеси инокулюма в сосудистую систему или нанесением инокулюма на разрез стебля, обычно у его основания, на расстоянии не выше 10 см от уровня почвы. Заражение плодов и корнеплодов производят путем нанесения суспензии спор патогена на их стерильную поверхность. Можно исполь-вовать сухие споры, прокалывая или надрезая кожицу плода, или вводить водную суспензию шприцем под кожицу. Заражение штаммов плодовых деревьев проводят в срезы на коре, сделанные с интервалом 1—1,5 см. Между двумя поперечными надрезами разрезают кору посередине в продольном направлении, отгибают ее и в неглубокие надрезы древесины вносят культуру патогена вместе с кусочком агаровой среды. Затем створки коры закрывают и место заражения обтягивают полиэтиленовой пленкой или пергаментом, закрепляя края шпагатом или клейкой лентой. Заражение листьев используют при работах с ржавчинными, головневыми, мучнисторосяными грибами. Растения помещают во влажную камеру (100%-ная относительная влажность) для стимулирования прорастания спор и заражения. В полевых опытах зараженные растения закрывают стеклянными колпаками. Среди факторов, способствующих развитию заболеваний, большое значение имеет плотность популяции фитопатогенного вида в почве. Плотность популяций — это число зародышей патогена на 1 г почвы или заселяемого растительного субстрата. Численность популяции" гриба, как правило, снижается в направлении от корней (особенно пораженных) к почве ризосферы и почве без растения и при гибели растения резко возрастает. Увеличение численности популяции фитопатоген-ных видов тесно коррелирует с увеличением потенциала инокулюма, т. е. с числом форм в популяции, обладающих вирулентными свойствами к определенным растениям. На потенциал инокулюма в почве влияют корневые выделения растений, длительность культивирования растений, характер растительных остатков, антибиотические вещества микроорганизмов — явления фунгистазиса почвы в целом (фунгистазис — способность нестерильной почвы ингибировать прорастание спор грибов, лизировать ростковце трубки и мицелий). Популяция того или иного вида гриба в ризосфере и на корнях растений состоит из изолятов, обладающих различными физиолого-биохимическими особенностями. Культуры, выделенные из разных растений, и моноспоровые отличаются интенсивностью роста мицелия и спорообразования, способностью синтеза ферментов (пектиназ, целллюлаз и др.), фитотоксинов, стимуляторов роста растений, витаминов группы В и других физиологически активных соединений. При этом одни изоляты образуют комплекс этих метаболитов в определенной последовательности в разных фазах роста, другие — только отдельные из них. Физиологические свойства отдельных изолятов грибов в некоторой степени определяют характер их воздействия на растение — стимуляцию корне-образования, роста и патологическое действие, приводящее к заболеванию растения.
Биологические свойства возбудителей
Обширная и сложная программа исследований биологических свойств грибов — возбудителей болезней растений — является одним из этапов научной разработки эффективных средств защиты растений. Она включает изучение особенностей морфогенеза возбудителей, влияния внешних факторов, компонентов питательной среды на их рост и развитие, определение характерных биохимических свойств организмов в лабораторных условиях. Так, например, у видов рода Fusarium установлены следующие морфогёнетические особенности: разнообразие типов спороношения (микро- и макроконидии), определенные их соотношения в изоляте (популяции). Микроконидии предназначены главным образом для массового заселения субстрата, они многочисленны, но не переживают в почве, в то же время у разных изолятов они разнока-чественны (по морфологии, размерам, физиологической зрелости, жизнеспособности). Особое значение для сохранения видов грибов имеют переживающие в почве структуры фитопатогенных видов, прежде всего мицелиаль-ные и конидиальные хламидоспоры, а также фрагменты мицелия с клетками хламидоспорового типа, склероции, мицелиальные тяжи. Они устойчивы к воздействию различных факторов — температуры, влажности, действию фунгицидов и др. Эти структуры существуют как в сапрофитной фазе, так и в тканях пораженного растения. Наличие переживающих структур создает потенциальную инфекционность, что может быть причиной увеличения численности инокулюма в сапрофитной или факультативно-паразитной фазе, образования рас, резистентных к фунгицидам и вирулентных. В связи с этим для фитопатологической характеристики отдельных видов грибов существенное значение имеет определение наличия и способности к прорастанию различных морфологических структур: конидий, хламидоспор, клеток мицелия склероциев в почве, тканях растения и растительных остатках. Способность к прорастанию нередко ингибируется споростазисом — образованием в почве веществ различной природы, ингибирующих процесс прорастания. Выяснение физиолого-биохимических механизмов действия патоге на на растение позволяет объяснить многие проявления его агрессивности. Обычно действие патогена обусловлено комплексом свойств гриба и растения. Так, при фузариозах сельскохозяйственных растений физиолого-биохимическое воздействие осуществляется двумя основными путями — ферментативным и токсигенным, хотя часто они взаимосвязаны и взаимообусловлены. Ферментативная активность гриба связана с проникновением его в ткани и клетки, т. е. с разрушением полимеров клеточной оболочки и межклеточного вещества растений — кутина, пектина, целлюлозы, гемицеллюлозы и др. Потребность в источниках углерода обеспечивается за счет ферментативного расщепления этих полимеров, освобождения легкоусвояемых мономеров, обеспечивающих интенсивный рост и спороношение гриба в пораженном растении. Путь ферментативного расщепления существенно нарушает процессы метаболизма растения, связанные с образованием клеточной оболочки и межклеточного вещества. Токсигенность, или фитотоксичность, патогена — это способность его образовывать более или менее видоспецифические вещества, ингибирующие отдельные метаболические процессы растения, снижающие его устойчивость, урожай или вызывающие его гибель.
Свежевыкопанные корни многократно промывают стерильной водой, отжимают в нескольких слоях стер'ильной фильтровальной бумаги, отрезками длиной 1—3 см или целиком (у проростков) укладывают на кружки стерильной фильтровальной бумаги в чашках Петри и ставят в термостат при температуре 26° С. Наблюдение за ростом грибов и их выделение производят через 24—48 ч и в последующие дни роста.
Относительную плотность заселения мицелия и численность грибов в прикорневой почве определяют путем растирания определенной навески после многократного смыва стерильной водой. Навеску свежевыделенных корней с приставшими к ним частицами почвы помещают в колбочку со стерильной водой, взбалтывают для освобождения корней от частиц почвы. После многократного промывания водой корни вынимают микологическим крючком, а взвесь почвенных частиц в воде фильтруют и взвешивают для определения массы почвы, приставшей к корням. По разнице между первоначальной навеской и массой почвы определяют массу корней. Смывы в определенном разведении высевают на кислый сусловый агар для определения численности и состава видов грибов в прикорневой почве. Растертые корни мерно высевают на кислый сусловый агар, подсчитывают число колоний и выделяют культуры. Плотность заселения определяют также на определенной поверхности.
Выделение из пораженной ткани
Скальпелем, прокаленным над пламенем горелки, делают срез поверхностной ткани по направлению от здоровой части к пораженной. На границе больной и здоровой ткани отрезают небольшой кусочек и переносят в пробирку с кислым сусловым агаром.
Выделение из сосудистой системы
Стебли и корни отмывают от почвы, стерилизуют поверхностно, прокаленным скальпелем разрезают стебель поперек на расстоянии 5— 15 см от корневой шейки и небольшой участок пораженного, побуревшего сосуда высевают на поверхность кислого суслового агара; отдельные кусочки ткани помещают во влажную камеру.
Выделение из стеблей и листьев
В ряде случаев грибы можно выделить не только из свежего материала, но и из гербарных образцов. Необходимым условием при сборе для этих целей является немедленная фиксация гербарного материала высушиванием, а также предохранение от заражения посторонней микофло-рой. Наиболее приемлемый метод приготовления гербарного материала — немедленное помещение листьев, стеблей или их частей в стерильный пакет из фильтровальной бумаги и высушивание их в этом пакете. После высушивания листьев пакет помещают во второй пакет, также стерильный, но из более плотной бумаги. В таком виде материал можно хранить до исследования. Материал помещают во влажную камеру, образцы просматривают под бинокулярной лупой. Выделение грибов производят через сутки и более.
Выделение из зерна хлебных злаков и семян
При выделении видов грибов, развивающихся во внутренних тканях зерна или семян, пользуются в основном методом влажной камеры. Зерна или семена после поверхностной дезинфекции укладывают на поверхность фильтровальной бумаги с интервалом 0,5—1,0 см; из одной исследуемой партии зерна среднего образца берут 100—1000 зерен. При этом следует принимать во внимание зараженность грибами и их пораженность. Зараженность определяют числом грибных зародышей в определенном количестве зерна; пораженность характеризуется степенью роста тех или иных видов грибов и поражения ими исследуемого субстрата. Зараженность определяют путем посева смыва определенной навески зерна или семян и последующего пересчета количества грибных организмов на единицу массы зерна.
Выделение из клубней, луковиц, корнеплодов
Выделение производят непосредственно из исследуемого материала либо после накопления на тканях этих органов мицелия грибов или их спороношения во влажной камере. В том и другом случае необходима поверхностная стерилизация и предварительный отмыв исследуемого материала от частиц почвы. При непосредственном выделении срезают стерильно небольшой кусочек на границе пораженной и здоровой ткани и помещают его на кислый сусловый агар. Для посевов делают серию срезов из разных мест здоровой и в разной степени пораженной ткани.
Селективные, или «приманочные», методы
Для выделения паразитных фитопатогенных грибов, не растущих на обычных питательных средах, используют растения-индикаторы, чувствительные к поражению, культуру тканей или органов растений, проростки или семена и стерильные среды, приготовленные на их основе. Например, чистая культура Phytophthora infestans может быть выделена при культивировании на стерильной ткани клубня картофеля, Erysiphe graminis — на проростках ячменя, Puccinia graminis f. tri-cini — на проростках пшеницы в стадии 2—3 листьев. Моноспоровую культуру можно получить заражением ткани или растения каплей, содержащей одну спору.
Метод элективного выделения специфических видов
Метод заключается в погружении в почву чувствительных к специфическим видам стерильных или нестерильных частей растений с последующим изъятием их и микологическим анализом. В этом случае необходимо забирать анализы в разные сроки и помещать во влажную камеру для выделения грибов, осуществляющих первичное заселение погружаемых частей растений,
Метод «контактных стекол»
Метод выделения микроорганизмов непосредственно из места их расположения в почве (метод Росси — Холодного). Стерильные предметные стекла прижимают к трещинам свежей почвы. Через несколько дней стекла встряхивают для освобождения от крупных комочков почвы и помещают на поверхность агаровой среды в чашку Петри стороной, соприкасавшейся с почвой. Выросшие грибы просматривают под малым увеличением микроскопа и после определенного периода инкубации колонии переносят на свежую среду.
Поддержание чистых культур
После выделения культур и своевременной их очистки от посторонних организмов следует поддерживать чистые культуры в жизнеспособном состоянии. Простейший способ поддержания чистых культур — пересев их через определенное время в. пробирки на косяки свежей агаровой среды. Периодичность пересевов зависит от вида гриба и определяется временем его выживаемости. Следует учитывать, что длительное выращивание грибов на искусственных средах может привести к изменению их свойств, в частности к потере патогенности или снижению вирулентности.
Специализация фитопатогенных
Специализация фитопатогенных грибов — приуроченность их к определенному виду, сорту питающего растения, способность (приспособленность) к паразитированию на одном или нескольких видах, сортах. Филогенетическая специализация патогена — избирательная способность его к поражению определенного набора видов питающих растений. Возбудители болезней с широкой специализацией называются широкоспециализированными, например Sclerotinia sclerotiorum — возбудитель белой гнили разных культур, Botrytis cinerea — возбудитель серой гнили. К узкоспециализированным возбудителям относятся, например, головневые и ржавчинные грибы (Ustiiago, Puccinia) и др. Приуроченность патогена к определенным тканям или органам в пределах одного растения называется тканевой, или органотропной, специализацией (антракноз смородины — Gloeosporium ribis (Lib.) Mont, ot Desm.; мучнистая роса огурца—Erysiphe cicchorocearum; кила капусты — Plasmodiophora brassicae и др.). Возрастная онтогенетическая, или возрастно-физиологическая, специализация — это приуроченность гриба к поражению отдельного органа растения определенного возраста. Например, Sphaerotheca mors-uvae поражает мучнистой росой только верхушечные молодые листочки крыжовника.
Специализированные формы и расы
Наличие одинаковых морфологических признаков у паразитов, развивающихся на разных питающих растениях, не исключает существования между ними биологического отличия, заключающегося в приуроченности отдельных форм одного и того же паразита к определенным растениям. Так, например, у стеблевой ржавчины, вызываемой Puccinia graminis, известно 10 специализированных форм, у Fusarium oxy-sporum — свыше 80. Специализированные формы неоднородны и могут состоять из еще более узкоспециализированных физиологических рас. Расы различаются в пределах вида по узкой приуроченности к поражению определенного круга сортов. Физиологические расы определяются по их патогенности к определенным растениям и сортам-дифференциаторам, которые подбирают для отдельных возбудителей с учетом биологических особенностей питающего растения. Изменение вирулентности отдельных рас фитопатогенных грибов, утрата или приобретение ими патогенных свойств обусловливается амплитудой изменчивости грибов и их адаптацией к различным условиям. Постоянная смена расового состава паразитов в природе зависит от изменения набора возделываемых сортов. Процесс формирования новой расы гриба можно представить в виде двух последовательных этапов. Первый этап — это появление новой расы в результате полового процесса, мутаций, гетерокариозиса или парасексуального процесса. Новая раса становится деятельной при наличии восприимчивого сорта. Второй этап заключается в вытеснении менее вирулентных рас восприимчивых растений, стабилизации популяции новой расы патогена. Устойчивость растений сохраняется довольно продолжительное время — до максимального накопления и распространения вновь возникшей расы. Внутри физиологических рас различают биотипы, характеризующиеся способностью паразитировать на отдельных сортах. При изучении расового состава ряда специализированных видов грибов, в частности ржавчинных и головневых, возбудителей мучнистой росы злаков, фитофторы картофеля и томатов, рака картофеля и других болезней, используют наборы сортов-дифференциаторов, которые инокулируют спорами грибов и учитывают характер поражения по шкалам иммуности. В настоящее время для каждого специализированного возбудителя разработаны методики определения вирулентности по отношению к международному набору сортов-дифференциаторов. При оценке вирулентности рас к разным растениям пользуются следующими показателями: устойчивость (резистентность) — способность растений поражаться грибами в очень слабой степени; выносливость (толерантность) — способность больных растений не снижать продуктивность или снижать ее незначительно; восприимчивость — неспособность растения противостоять заражению и распространению патогена. Различают вертикальную устойчивость — к нескольким расам возбудителя — и горизонтальную (полевую) — ко всем расам паразита. Устойчивость проявляется в двух формах: аксении и защитной реакции. Аксения — устойчивость, существующая до заражения и препятствующая ему; обусловливается морфологическими, химическими, физиологическими или физиолого-морфологическими особенностями растения. Защитная реакция вырабатывается растением в процессе инокуляции.
Методы искусственного заражения
Приемы инокуляции растений довольно разнообразны и зависят от биологии гриба и роли инфекции в патогенезе заболевания, а также от целей исследования (проверка патогенности штаммов, оценка устойчивости сортов и т. п.). Инокуляцию проводят как патогеном, выросшим на искусственной питательной среде, так и спорами природной популяции гриба. Методы инокуляции растений весьма разнообразны. Для разных культур и заболеваний существуют разные методы создания инфекционного фона и способы заражения культур, общими условиями при которых является соблюдение чистых культур используемого изолята, стандартизация условий культивирования (среда, температура, густота посева, возраст и др.). Для получения сравнимых результатов и выяснения инфекционной нагрузки необходима количественная характеристика инокулюма: содержание разных видов спор (макроконидий, микроконидий, хламидоспор) в единице массы или объема используемой культуры. Споровый материал для заражения может быть получен из гербария естественно зараженного растения (головня, ржавчина, мучнистая роса) и при культивировании гриба. В первом случае споровый материал собирают в зависимости от способа спорообразования (плодовые тела базидиальных и сумчатых грибов, спорангиоспоры, конидии на мицелии, в спородохиях, коремиях, пикнидах и т. д.) и локализации гриба в растении на стерильную бумагу или в чашки Петри с соблюдением стерильности для предохранения загрязнения исходного материала вторичной микрофлорой. Плодовые тела или стерильно собранные споры переносят препаровальной иглой в стерильную пробирку или чашку с водой и, освободив споры от плодовых тел, получают взвесь спорового материала, а после удаления воды — сухой споровый материал. Заражение через почву для создания инфекционного фона включает следующие приемы: приготовление и стерилизацию почвы, заражение ее грибами и равномерное размешивание (учитывается количество конидий и хламидоспор в 1 г зараженной почвы), выращивание проростков здоровых растений, их посадку в сосуды с зараженной почвой. Затем сосуды равномерно увлажняют и помещают в камеры или вегетационный домик при соответствующей для данного вида растения температуре и освещении. Заражение семян осуществляется путем опыливания сухими спорами, опрыскивания водной взвесью конидий или погружением в нее семян незадолго до посева. Заражение поврежденных и неповрежденных тканей также производят взвесью конидий путем опрыскивания, нанесения кисточкой, опиливанием сухими конидиями или втиранием их массы. Для получения зараженных семян инокулируют цветы. Заражение через сосудистую систему производят введением шприцем взвеси инокулюма в сосудистую систему или нанесением инокулюма на разрез стебля, обычно у его основания, на расстоянии не выше 10 см от уровня почвы. Заражение плодов и корнеплодов производят путем нанесения суспензии спор патогена на их стерильную поверхность. Можно исполь-вовать сухие споры, прокалывая или надрезая кожицу плода, или вводить водную суспензию шприцем под кожицу. Заражение штаммов плодовых деревьев проводят в срезы на коре, сделанные с интервалом 1—1,5 см. Между двумя поперечными надрезами разрезают кору посередине в продольном направлении, отгибают ее и в неглубокие надрезы древесины вносят культуру патогена вместе с кусочком агаровой среды. Затем створки коры закрывают и место заражения обтягивают полиэтиленовой пленкой или пергаментом, закрепляя края шпагатом или клейкой лентой. Заражение листьев используют при работах с ржавчинными, головневыми, мучнисторосяными грибами. Растения помещают во влажную камеру (100%-ная относительная влажность) для стимулирования прорастания спор и заражения. В полевых опытах зараженные растения закрывают стеклянными колпаками. Среди факторов, способствующих развитию заболеваний, большое значение имеет плотность популяции фитопатогенного вида в почве. Плотность популяций — это число зародышей патогена на 1 г почвы или заселяемого растительного субстрата. Численность популяции" гриба, как правило, снижается в направлении от корней (особенно пораженных) к почве ризосферы и почве без растения и при гибели растения резко возрастает. Увеличение численности популяции фитопатоген-ных видов тесно коррелирует с увеличением потенциала инокулюма, т. е. с числом форм в популяции, обладающих вирулентными свойствами к определенным растениям. На потенциал инокулюма в почве влияют корневые выделения растений, длительность культивирования растений, характер растительных остатков, антибиотические вещества микроорганизмов — явления фунгистазиса почвы в целом (фунгистазис — способность нестерильной почвы ингибировать прорастание спор грибов, лизировать ростковце трубки и мицелий). Популяция того или иного вида гриба в ризосфере и на корнях растений состоит из изолятов, обладающих различными физиолого-биохимическими особенностями. Культуры, выделенные из разных растений, и моноспоровые отличаются интенсивностью роста мицелия и спорообразования, способностью синтеза ферментов (пектиназ, целллюлаз и др.), фитотоксинов, стимуляторов роста растений, витаминов группы В и других физиологически активных соединений. При этом одни изоляты образуют комплекс этих метаболитов в определенной последовательности в разных фазах роста, другие — только отдельные из них. Физиологические свойства отдельных изолятов грибов в некоторой степени определяют характер их воздействия на растение — стимуляцию корне-образования, роста и патологическое действие, приводящее к заболеванию растения.
Биологические свойства возбудителей
Обширная и сложная программа исследований биологических свойств грибов — возбудителей болезней растений — является одним из этапов научной разработки эффективных средств защиты растений. Она включает изучение особенностей морфогенеза возбудителей, влияния внешних факторов, компонентов питательной среды на их рост и развитие, определение характерных биохимических свойств организмов в лабораторных условиях. Так, например, у видов рода Fusarium установлены следующие морфогёнетические особенности: разнообразие типов спороношения (микро- и макроконидии), определенные их соотношения в изоляте (популяции). Микроконидии предназначены главным образом для массового заселения субстрата, они многочисленны, но не переживают в почве, в то же время у разных изолятов они разнока-чественны (по морфологии, размерам, физиологической зрелости, жизнеспособности). Особое значение для сохранения видов грибов имеют переживающие в почве структуры фитопатогенных видов, прежде всего мицелиаль-ные и конидиальные хламидоспоры, а также фрагменты мицелия с клетками хламидоспорового типа, склероции, мицелиальные тяжи. Они устойчивы к воздействию различных факторов — температуры, влажности, действию фунгицидов и др. Эти структуры существуют как в сапрофитной фазе, так и в тканях пораженного растения. Наличие переживающих структур создает потенциальную инфекционность, что может быть причиной увеличения численности инокулюма в сапрофитной или факультативно-паразитной фазе, образования рас, резистентных к фунгицидам и вирулентных. В связи с этим для фитопатологической характеристики отдельных видов грибов существенное значение имеет определение наличия и способности к прорастанию различных морфологических структур: конидий, хламидоспор, клеток мицелия склероциев в почве, тканях растения и растительных остатках. Способность к прорастанию нередко ингибируется споростазисом — образованием в почве веществ различной природы, ингибирующих процесс прорастания. Выяснение физиолого-биохимических механизмов действия патоге на на растение позволяет объяснить многие проявления его агрессивности. Обычно действие патогена обусловлено комплексом свойств гриба и растения. Так, при фузариозах сельскохозяйственных растений физиолого-биохимическое воздействие осуществляется двумя основными путями — ферментативным и токсигенным, хотя часто они взаимосвязаны и взаимообусловлены. Ферментативная активность гриба связана с проникновением его в ткани и клетки, т. е. с разрушением полимеров клеточной оболочки и межклеточного вещества растений — кутина, пектина, целлюлозы, гемицеллюлозы и др. Потребность в источниках углерода обеспечивается за счет ферментативного расщепления этих полимеров, освобождения легкоусвояемых мономеров, обеспечивающих интенсивный рост и спороношение гриба в пораженном растении. Путь ферментативного расщепления существенно нарушает процессы метаболизма растения, связанные с образованием клеточной оболочки и межклеточного вещества. Токсигенность, или фитотоксичность, патогена — это способность его образовывать более или менее видоспецифические вещества, ингибирующие отдельные метаболические процессы растения, снижающие его устойчивость, урожай или вызывающие его гибель.
